段利瑤 凌彥博 梁艷 史迎昌 王蘭 趙冠人 劉軍 鄭越 吳雪瓊

中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方牛貝消核在臨床上已應(yīng)用長達(dá)16年，由川貝母(Bulbus Fritillariae Cirrhosae)、白及(Rhizoma Bletillae)、魚腥草(Herba Houttuyniae)、桔梗(Radix Platycodonis)、牛蒡子(Fructus Arctii)和糯米(Glutinous rice)6味中藥組成。其中，川貝母和白及為君藥，川貝母具有潤肺止咳，清熱化痰的功效，主治虛勞久咳、肺熱燥咳和咯痰帶血等癥[1]，白及具有抗菌、止血、抗纖維化和抗氧化等多種藥理作用[2]；魚腥草、桔梗和牛蒡子為臣藥，魚腥草多用于肺癰吐膿、癰腫瘡毒和痰熱喘咳等，桔梗宣肺、利咽、祛痰和排膿，牛蒡子有宣肺透疹、解毒利咽和疏散風(fēng)熱的功效[3]；益肺氣、健脾胃的糯米為佐使藥。因此，本方6味中藥配伍合理，具有軟堅(jiān)化結(jié)、清熱解毒、止咳化痰和滋陰潤肺的功效，能夠消除咳嗽、胸痛、低熱、咯血和消瘦等結(jié)核病癥狀。

中醫(yī)藥文化是中華民族傳統(tǒng)文化的精髓，具有廣闊的發(fā)展前景。然而中藥成分復(fù)雜，每味中藥都含有數(shù)十種甚至上百種成分，而其在體內(nèi)的效應(yīng)大多是多種成分協(xié)同作用的結(jié)果。中藥傳統(tǒng)的口服給藥形式?jīng)Q定了只有被吸收進(jìn)入體內(nèi)的物質(zhì)才能產(chǎn)生活性，且吸收進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮作用的并非一定是原形成分，也可能是其代謝產(chǎn)物[4]。中藥血清藥物化學(xué)是以中藥口服給藥后血清為樣品，應(yīng)用藥物化學(xué)的研究方法，聯(lián)合多種現(xiàn)代化技術(shù)，從血清中分離、鑒定移行成分，研究血清中移行成分與傳統(tǒng)療效的相關(guān)性，闡明體內(nèi)直接作用物質(zhì)代謝及體內(nèi)動態(tài)變化的領(lǐng)域[5]。目前，中藥血清藥物化學(xué)得到廣泛應(yīng)用，為中藥的研究提供了一種新的研究思路，有利地推動了中藥的發(fā)展。本研究應(yīng)用高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography, HPLC)初步研究牛貝消核提取物的主要有效成分在血液中的移行變化，確定牛貝消核作用的主要入血藥效成分，試圖闡明其在動物體內(nèi)移行成分與傳統(tǒng)療效的相關(guān)性，為其體內(nèi)直接作用物質(zhì)代謝及體內(nèi)動態(tài)規(guī)律研究奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1. 實(shí)驗(yàn)儀器：高效液相色譜儀(DGU-20A3prominence DEGASSER，配二元梯度泵、自動進(jìn)樣器)； Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)；KQ-300GVDV型三頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；QL-901型旋蝸混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(Centrifuge 5418，Eppendorf)。

2. 藥品與試劑: (1)牛貝消核提取物：牛貝消核提取物干浸膏粉委托西安新通藥物研究有限公司生產(chǎn)，批號為180901；(2)乙腈：色譜純，美國賽默飛世爾科技有限公司；(3)甲醇：色譜純，美國賽默飛世爾科技有限公司；(4)牛蒡苷(Arctiin)標(biāo)準(zhǔn)品：中國食品藥品檢定研究院，批號110819-201711；(5)白及標(biāo)準(zhǔn)品：批號BWB51613，中國世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；(6)牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)品：批號120903-201710，中國世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；(7)桔梗標(biāo)準(zhǔn)品：批號121028-201712，中國世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；(8)魚腥草標(biāo)準(zhǔn)品：批號BWB51804，中國世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。

3. 實(shí)驗(yàn)動物:清潔級BALB/c雌性小鼠55只，6～8周齡，體質(zhì)量19～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[許可證號SCXK(京)2016～0006]。

二、方法

1. 體外供試品溶液的制備:稱取牛貝消核提取物1.00 g，溶于40 ml蒸餾水，混勻，99 ℃加熱1 h助溶，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，作為體外供試品溶液；稱取牛蒡子、桔梗、魚腥草、白及標(biāo)準(zhǔn)品及牛蒡苷標(biāo)準(zhǔn)品10 mg分別溶于600 μl甲醇，渦旋混勻，置離心半徑為8.9 cm的離心機(jī)，于13 000 r/min離心10 min，取上清。

2. 空白及含藥血清樣品的制備：55只小鼠按照數(shù)字表法隨機(jī)分為11組，灌胃給藥體積為 0.2 ml/10 g。1～5組為牛貝消核提取物組，每只小鼠每天給予 1.25 mg/g牛貝消核提取物，連續(xù)灌胃給藥7 d；6～10組為牛蒡苷組，每只小鼠每天給予 0.3 mg/g牛蒡苷，連續(xù)灌胃給藥7 d；11組為空白對照組，給予蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃7 d。每組小鼠于末次灌胃給藥后0.5、1、2、4、6 h小鼠眼眶后靜脈叢取血，血樣置離心半徑16.7 cm的離心機(jī)，于3000 r/min 離心10 min，吸取上清液；上清液200 μl加入乙腈400 μl(1∶2)，渦旋混勻，置離心半徑為8.9 cm的離心機(jī)，于13 000 r/min離心10 min，取上清，作為血清供試品溶液。

3. 色譜條件: 2018年4月至2019年6月在中國人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心全軍結(jié)核病研究所采用高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography, HPLC)分析，采用色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)，紫外檢測器檢測波長210 nm，流速1.0 ml/min，最大進(jìn)樣體積為100 μl，流動相為水(A)～80%乙腈(B)，梯度洗脫程序：0～30 min，流動相A比例由100.0%降至0，流動相B比例由0增至100.0%；30～35 min，流動相A比例由0增至100.0%，流動相B比例由100.0%降至0。

4. 牛貝消核提取物及其血清中成分分析：取牛貝消核提取物溶液，以及含藥血清樣品在相同的色譜條件下進(jìn)行 HPLC分析，建立其指紋圖譜，并比較分析確定入血成分。然后參照對照品初步鑒定牛貝消核提取物的入血成分。

結(jié) 果

一、 牛貝消核提取物的HPLC分析結(jié)果

牛貝消核提取物的HPLC圖見圖1，與牛蒡子、桔梗、魚腥草、白及標(biāo)準(zhǔn)品圖譜比較，在同一色譜條件下，發(fā)現(xiàn)峰1保留時間為7.1 min，峰2保留時間為13.5 min，峰3保留時間為15.5 min，峰4保留時間為16.3 min，峰5保留時間為21.2 min。同時，牛蒡苷保留時間為16.3 min(圖2)。

注 a：牛蒡子，b：桔梗，c：牛貝消核提取物，d：魚腥草，e：白及；牛貝消核提取物(c)中峰1對應(yīng)的物質(zhì)來源于桔梗(b)，峰2、3、5對應(yīng)的物質(zhì)來源于白及(e)，峰4對應(yīng)的物質(zhì)來源于牛蒡子(a)圖1 牛貝消核提取物與藥材標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖

注 a：牛貝消核提取物，b：牛蒡苷圖2 牛貝消核提取物和牛蒡苷標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖

二、 牛貝消核含藥血清樣本HPLC分析結(jié)果

牛蒡苷標(biāo)準(zhǔn)品體外樣品色譜圖顯示牛蒡苷保留時間為16.3 min，牛蒡苷灌胃給藥后并未明顯檢測出牛蒡苷成分，但灌胃給藥后0.5、1、2、4、6 h血清與空白血清色譜圖比較，圖譜中清晰可見17.5～22.5 min有吸收峰，且隨時間的變化而改變，2 h達(dá)吸收最高峰，4 h開始下降。同時牛貝消核灌胃后在此時間段也出現(xiàn)相同特征的吸收峰，且0.5 h的吸收峰最高，1 h開始下降。詳見圖3、4。

注 a：牛蒡苷標(biāo)準(zhǔn)品，b～f：牛蒡苷灌胃后0.5、1、2、4、6 h圖3 牛蒡苷標(biāo)準(zhǔn)品小鼠血清藥物化學(xué)分析HPLC圖

注 a：空白血清，b～f：牛貝消核提取物灌胃后0.5、1、2、4、6 h圖4 牛貝消核提取物小鼠血清藥物化學(xué)分析HPLC圖

討 論

目前，絕大部分中藥及復(fù)方只能采用口服方式給藥，口服中藥后的血清中含有真正的有效成分，即原形成分、代謝產(chǎn)物、機(jī)體產(chǎn)生的生理活性物質(zhì)[6]。因此，通過分析口服給藥后血清中成分，確定中藥及復(fù)方在體內(nèi)的直接作用物質(zhì)，將成為準(zhǔn)確、快速的確定中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的有效途徑。

通過牛貝消核提取物與藥材標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖比較發(fā)現(xiàn)，峰1來源于桔梗，峰2、3、5來源于白及，峰4來源于牛蒡子，并在牛貝消核提取物中鑒定出牛蒡苷化合物，表明通過HPLC分析可作為牛貝消核提取物中桔梗、白及、魚腥草和牛蒡子提取的質(zhì)量控制方法。其中桔梗具有宣肺、利咽、祛痰和排膿等多種藥理作用，白及具有抗菌、止血、抗纖維化和抗氧化的作用[2]，牛蒡子有宣肺透疹、解毒利咽和疏散風(fēng)熱的功效，并且牛蒡苷是牛蒡子的主要活性成分，具有較強(qiáng)的抗炎及免疫調(diào)節(jié)活性、抗病毒活性[3]。結(jié)合各味中藥藥理活性及研究數(shù)據(jù)，推斷牛貝消核所發(fā)揮藥效的物質(zhì)分別來源于桔梗、白及和牛蒡子中主要的活性物質(zhì)，并選用牛蒡苷為對照進(jìn)行牛貝消核血清藥物化學(xué)的初步研究。

樣品預(yù)處理是為了分離基質(zhì)和共存的干擾物質(zhì)，富集待測成分，純化樣品，提高檢測敏感度。血漿、血清等生物樣品中的主要干擾物質(zhì)為氨基酸、蛋白質(zhì)、磷脂和多肽等。在色譜分離中，這些干擾物質(zhì)產(chǎn)生的雜質(zhì)峰有可能會與待測成分產(chǎn)生的色譜峰重疊，從而干擾實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。生物樣品處理的方法主要包括：蛋白沉淀法、固相萃取法、液液萃取法等[7]。蛋白沉淀法是在樣品中加入有機(jī)溶劑(甲醇、乙腈、丙酮等)、有機(jī)酸、重金屬鹽等將蛋白沉淀，純化樣品血樣與有機(jī)試劑體積比一般為1∶1～1∶4時，可將97%以上的蛋白除去[8]，Chen等[9]應(yīng)用甲醇/乙腈混合溶液沉淀蛋白以純化血樣，對黃芪顆粒藥效學(xué)與血清藥物化學(xué)質(zhì)量評估進(jìn)行研究。Zhang等[10]則采用甲酸來沉淀蛋白對三子固本顆粒質(zhì)量評估進(jìn)行研究。He等[11]用乙腈直接沉淀蛋白后對牛蒡子苷的體內(nèi)吸收藥代動力學(xué)進(jìn)行研究。王宇卿等[12]的研究顯示乙腈沉淀法得到的樣品色譜圖信息量較大，干擾少。根據(jù)以上研究，筆者采用乙腈沉淀蛋白的方法進(jìn)行預(yù)處理。

參考胥秀英等[13]的研究，本研究采用了足夠劑量的牛蒡苷灌胃。牛蒡苷HPLC體內(nèi)分析結(jié)果提示并未明顯檢測出牛蒡苷成分，但發(fā)現(xiàn)2個高低不同的吸收峰，而牛貝消核提取物灌胃后也檢測出與牛蒡苷相似的2個吸收峰，推測可能檢測出牛蒡苷的代謝產(chǎn)物。Wang等[14]對口服牛蒡苷的藥代動力學(xué)研究表明，牛蒡苷在口服后快速吸收，隨后迅速消失。鄭一敏等[15]報(bào)道，牛蒡苷在動物體內(nèi)代謝變化快速、受雜質(zhì)干擾小，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較好，且牛蒡苷在體內(nèi)吸收很快，消除也快。牛蒡苷的代謝產(chǎn)物有牛蒡子苷元、(-)-腸內(nèi)酯、(-)-牛蒡子苷、[(2R, 3R)-2-(3′-羥基苯甲基)-3-(3″,4″-二甲氧基苯甲基)-丁內(nèi)酯[14,16]。本研究還需進(jìn)一步研究確定這些吸收峰是否為牛蒡苷的代謝產(chǎn)物，是什么代謝產(chǎn)物，是否可作為牛貝消核體內(nèi)血藥濃度檢測的標(biāo)志物。牛貝消核體內(nèi)分析只明顯檢測出與牛蒡苷代謝產(chǎn)物相同特征的吸收峰，并未明顯檢測出其他吸收峰，可能是由于中藥化學(xué)組分復(fù)雜，有效成分含量較低，生物利用度低。由于牛貝消核體外HPLC結(jié)果顯示可以明確檢測出牛蒡苷成分，因此本研究暫時只選用牛蒡苷作為對照，通過后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件及設(shè)備的不斷改善，今后實(shí)驗(yàn)中會選擇更多有效成分作為對照。

本研究首次運(yùn)用HPLC對牛貝消核提取物的血清藥物化學(xué)進(jìn)行研究，結(jié)果提示牛貝消核提取物入血藥效成分微量，血中移行成分推測為牛蒡苷代謝產(chǎn)物。后續(xù)研究需進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)設(shè)施，為牛貝消核體內(nèi)直接作用物質(zhì)代謝及體內(nèi)動態(tài)規(guī)律研究奠定基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突