吳超玲 鄧國(guó)防 付亮 袁小亮

自古以來(lái)，呼出氣就被認(rèn)為是病理生理過(guò)程的診斷線索。利用呼出的揮發(fā)性有機(jī)化合物(volatile organic compound，VOC)進(jìn)行疾病診斷可以追溯到古希臘文明，在那時(shí)“醫(yī)學(xué)之父”希波克拉底就提出利用呼吸分析來(lái)診斷各種疾病。例如，一些糖尿病酮癥酸中毒患者的呼出氣有爛蘋(píng)果氣味，肝病患者會(huì)有魚(yú)腥味[1-2]，厭氧菌感染的肺膿腫患者的呼出氣有類似下水道氣味，而有機(jī)磷中毒的患者在呼吸時(shí)有大蒜氣味[3]。這些基本氣味檢測(cè)試驗(yàn)可被視為呼吸分析的基礎(chǔ)。到20世紀(jì)，我們見(jiàn)證了呼吸分析領(lǐng)域的成就，1971年諾貝爾獎(jiǎng)得主生物化學(xué)家Linus Pauling使用氣相色譜法描述了人類呼出氣中250種VOC的情況，發(fā)現(xiàn)這些VOC來(lái)源于許多內(nèi)源性生化過(guò)程，包括脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的醛、烷烴，以及碳水化合物和脂肪酸代謝產(chǎn)生的酮[4-5]。然而，直到1985年Gordon等[6]才首次證明了呼出氣VOC在肺癌早期診斷中的可行性。這種VOC與人類疾病的早期關(guān)聯(lián)為在肺部疾病早期診斷中使用呼吸分析奠定了重要基礎(chǔ)。

一、VOC概述

VOC是一種具有高揮發(fā)性的氣態(tài)有機(jī)分子，人體的VOC來(lái)源于多種體內(nèi)代謝途徑，并通過(guò)皮膚、糞便、尿液和呼吸釋放。由于細(xì)胞代謝因疾病而改變，因此VOC的變化可以作為特定病理生理狀況的生物標(biāo)志物。在呼吸系統(tǒng)疾病中，呼出氣因其與呼吸道的緊密接觸而受到特別關(guān)注。完整的人體呼出氣由數(shù)千種化合物組成[7]，呼出氣VOC分為外源性和內(nèi)源性。外源性VOC來(lái)自環(huán)境，并通過(guò)呼吸道和消化道等途徑進(jìn)入機(jī)體。體內(nèi)產(chǎn)生的VOC可以是宿主生理代謝過(guò)程的產(chǎn)物，也可以是微生物病原體代謝過(guò)程的產(chǎn)物，或者是宿主對(duì)諸如感染或炎癥等過(guò)程的病理反應(yīng)性產(chǎn)物[8]。VOC是一種低相對(duì)分子質(zhì)量、高蒸汽壓的碳基化合物，這種特性使得它們很容易在環(huán)境中擴(kuò)散[9]?；颊吆舫鰵鈾z測(cè)技術(shù)是疾病診斷的新方法，自發(fā)展以來(lái)受到研究者的廣泛關(guān)注，近年來(lái)利用呼出氣檢測(cè)診斷非感染性疾病(如支氣管哮喘、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等)和感染性疾病[如肺結(jié)核、新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)]均取得了一定進(jìn)展[7]。對(duì)于感染性疾病，病原微生物感染機(jī)體后，經(jīng)過(guò)體內(nèi)代謝，可產(chǎn)生廣泛的VOC，如烴、醇、酮類，以及含氮和含硫化合物等。宿主或病原微生物新陳代謝的變化可能會(huì)影響呼出氣組分，不同種屬的微生物在人體組織微環(huán)境中生長(zhǎng)代謝時(shí)產(chǎn)生的VOC種類不同，使得檢測(cè)其代謝譜和特異性物質(zhì)成為可能。呼出氣VOC檢測(cè)具備無(wú)創(chuàng)、取樣簡(jiǎn)單、速度快等優(yōu)勢(shì)，有較大的應(yīng)用價(jià)值。

二、VOC的采集方法

呼出氣VOC的采集應(yīng)避免環(huán)境VOC的污染，人體的呼出氣包括來(lái)自上呼吸道的150 ml生理死腔氣和來(lái)自肺泡深處的350 ml肺泡氣。因此，可以收集兩種基本類型的呼出氣進(jìn)行呼吸分析。一種是包含死腔氣和肺泡氣的混合呼出氣，另一種是肺泡(或呼氣末)氣體。其中，混合呼出氣采集簡(jiǎn)單，無(wú)需額外設(shè)備，但生理死腔氣會(huì)稀釋呼出氣中VOC的濃度；而肺泡氣中外源性污染物濃度較低，其內(nèi)源性VOC的濃度比混合呼出氣高2～3倍[10]。人體呼出氣VOC的采集過(guò)程可分為在線采樣(又稱為“直接采樣”)和離線采樣(又稱為“間接采樣”)。在線采樣為呼出氣直接被引入測(cè)量分析系統(tǒng)，可以同時(shí)完成氣體的收集和分析，而對(duì)于離線采樣，呼出氣在輸送到儀器進(jìn)行分析之前存儲(chǔ)在容器中(Tedlar袋、Summa罐、熱吸附管等)。在離線收集中，呼出氣樣本通常由取樣裝置收集，如注射器[11]、Bio-VOC針筒[12]，或二氧化碳傳感器[13-14]，然后轉(zhuǎn)移并儲(chǔ)存在容器(如Tedlar袋)中。Tedlar袋因其成本低、易于儲(chǔ)存和可重復(fù)使用而被廣泛用于臨床研究[15]。

三、VOC的檢測(cè)技術(shù)

1.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)：GC-MS廣泛應(yīng)用于呼吸分析，特別是用于識(shí)別和解釋人類呼吸中存在的VOC，被認(rèn)為是呼吸分析的金標(biāo)準(zhǔn)[16]。GC-MS主要由離子源、質(zhì)量分析器和檢測(cè)器組成。在離子源的作用下，分析樣品被碎片化，形成帶電離子。而在質(zhì)量分析器的作用下將樣品離子按照質(zhì)量-電荷比(mass-to-charge ratio，m/z)的大小分成不同的離子流。而不同的離子流在檢測(cè)器中的信號(hào)強(qiáng)度不同，在經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)處理后形成質(zhì)譜圖可用于分析[16]。雖然具有高度敏感性和可重復(fù)性，但其預(yù)處理步驟繁瑣、整個(gè)檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，因而無(wú)法走出實(shí)驗(yàn)室。近年來(lái)，已經(jīng)出現(xiàn)了很多使用GC-MS來(lái)檢查肺部病變特定VOC的研究[17]。然而，標(biāo)準(zhǔn)化的方法和平臺(tái)的缺乏，限制了這項(xiàng)技術(shù)在多中心比較研究中的進(jìn)一步探索。

2.質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜(proton transfer reaction mass spectrometry，PTR-MS)和選擇離子流動(dòng)管質(zhì)譜(selected ion flow tube mass spectrometry，SIFT-MS)：PTR-MS具有實(shí)時(shí)分析的能力，典型的時(shí)間分辨率為100 ms，盡管速度很快，但缺乏預(yù)濃縮過(guò)程會(huì)限制其敏感度。VOC通過(guò)將試劑離子水合氫離子中的一個(gè)質(zhì)子轉(zhuǎn)移到任何具有合適質(zhì)子親和力的分子上而被電離，然后在質(zhì)譜儀中分離出來(lái)[18]。SIFT-MS將快速流動(dòng)管技術(shù)與質(zhì)譜定量分析結(jié)合，用于呼出氣中痕量氣體的實(shí)時(shí)定量測(cè)量[19-20]。二者都屬于軟電離在線質(zhì)譜技術(shù)，通過(guò)將物質(zhì)分子電離而極少解離，得到易于快速定性和定量分析的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，使其能夠用于呼出氣等復(fù)雜混合物樣品的快速定性定量分析，已在人體呼出氣及尿液中小分子揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的在線檢測(cè)中取得成功[21-22]。PTR-MS和SIFT-MS的主要優(yōu)點(diǎn)是分析速度快和敏感度高，具有從十億分之一(part per billion，PPB)水平到萬(wàn)億分之一(part per trillion，PPT)水平測(cè)量VOC的潛力。然而，這兩種儀器都很昂貴，需要專業(yè)人員定期維護(hù)。

3.電子鼻(electronic noses，eNose)：eNose是可應(yīng)用于呼吸分析的一種簡(jiǎn)單設(shè)備，它大致模仿人類的嗅覺(jué)，由多個(gè)陣列傳感器組成，這些傳感器被編程為識(shí)別不同的氣味，并將它們與預(yù)先編程的模式進(jìn)行比較[23]。eNose通常不需要昂貴的組件或熟練的操作人員，操作時(shí)間相對(duì)較短，幾分鐘就能得出結(jié)果，技術(shù)成本較低，對(duì)于氣道疾病以及早期肺癌診斷具有良好的鑒別能力[24-25]。如上所述，eNose有望成為各種肺部疾病的強(qiáng)大篩查工具，但需要大規(guī)模的臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證，而且它的敏感度有限，容易出現(xiàn)盲點(diǎn)，對(duì)于分析特定的VOC有時(shí)需要額外的設(shè)備[26]，無(wú)法識(shí)別復(fù)雜混合物中的化合物。

4.實(shí)時(shí)高氣壓光電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(high-pressure photon ionization time-of-flight mass spectrometry，HPPI-TOFMS)：高氣壓光電離(HPPI)電離效率高、分子離子產(chǎn)量高，以及碎片化程度低[27]等功能，使得HPPI-TOFMS成為一種很有前途的呼吸測(cè)試工具，因?yàn)槊舾卸雀撸恍枰獙?duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或VOC濃縮，分析樣品只需 60 s，并且對(duì)濕度具有很大的耐受性[28-29]。HPPI-TOFMS已經(jīng)成功監(jiān)測(cè)了手術(shù)過(guò)程中呼出的異丙酚濃度，并顯示出與血液異丙酚濃度和雙光譜指數(shù)良好的相關(guān)性[30-31]，最近發(fā)表的應(yīng)用于肺癌及食管癌患者呼出氣VOC檢測(cè)的研究都顯示出較高的敏感度和特異度[13-14]。如上所述，HPPI-TOFMS具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值，然而仍需要進(jìn)一步的大規(guī)模驗(yàn)證。

四、VOC在肺部感染性疾病中的研究現(xiàn)狀

(一)病毒感染

1. COVID-19：COVID-19是一種由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2，SARS-CoV-2)導(dǎo)致的傳染性疾病。目前正在發(fā)生的COVID-19疫情表明，需要無(wú)創(chuàng)、快速和準(zhǔn)確的檢測(cè)方法來(lái)進(jìn)行篩查和診斷，以遏制高傳染性病毒感染的傳播。盡管SARS-CoV-2逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)和抗原檢測(cè)在過(guò)去一年中得到了廣泛應(yīng)用，但這些檢測(cè)方法在診斷及可用性方面仍然受限。為了縮短檢測(cè)時(shí)間并使大規(guī)模篩查更加可行，基于呼吸的VOC分析已被提議作為一種替代的取樣和檢測(cè)技術(shù)[32]。Grassin-Delyle等[33]對(duì)因患有嚴(yán)重COVID-19和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)而接受有創(chuàng)機(jī)械通氣治療的成人的呼出氣進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)呼出氣中的4種VOC(甲基戊二烯、2,4-辛二烯、1-氯庚烷和壬烷)可用于區(qū)分COVID-19和非COVID-19(ARDS)患者，但該研究樣本量較小且沒(méi)有外部驗(yàn)證。Ruszkiewicz等[34]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，醛(乙醛、辛醛)、酮(丙酮、丁酮)和甲醇能夠區(qū)分COVID-19患者和其他疾病患者，包括支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、細(xì)菌性肺炎和心臟病。Berna等[35]調(diào)查了26例疑似COVID-19兒童的呼出氣，發(fā)現(xiàn)感染患兒中有6種VOC(辛醛、壬醛、庚醛、癸烷、十烷和2-戊基呋喃)明顯增加。雖然樣本量很小，但該研究的敏感度和特異度分別為100%和66.6%。Jendrny等[36]通過(guò)狗的氣味識(shí)別來(lái)描述COVID-19患者的特征，他們訓(xùn)練18只狗區(qū)分來(lái)自COVID-19患者的唾液或氣管支氣管分泌物樣本與未感染對(duì)照組的樣本，為期1周，旨在追蹤SARS-CoV-2感染的特定氣味。這些狗能識(shí)別來(lái)自SARS-CoV-2感染患者的樣本，平均診斷敏感度為82.63%，特異度為96.35%，但動(dòng)物之間的表現(xiàn)存在明顯差異。Wintjens等[37]使用eNose對(duì)219例無(wú)癥狀患者進(jìn)行術(shù)前篩查，并報(bào)告了86%的敏感度和96%的陰性預(yù)測(cè)值。盡管前景良好，但尚不清楚這些信號(hào)是否對(duì)SARS-CoV-2具有特異性，或是否能代表呼吸道感染引起的可泛化的代謝變化，這些問(wèn)題值得進(jìn)一步研究。

2.甲型流感：甲型流感病毒不僅自身會(huì)導(dǎo)致呼吸道感染，而且還經(jīng)常與化膿性鏈球菌等細(xì)菌一起造成嚴(yán)重的混合感染。Traxler等[38]報(bào)道，使用定制的采樣系統(tǒng)分析了來(lái)自共感染細(xì)胞培養(yǎng)基的頂層空間氣體中的VOC。為了研究甲型流感的單一感染和體外病毒-細(xì)菌共感染，研究者通過(guò)針阱微萃取和GC-MS分析接種甲型流感病毒和化膿性鏈球菌的細(xì)胞中的VOC，還分析了細(xì)胞培養(yǎng)基排放、未感染細(xì)胞和細(xì)菌單感染細(xì)胞的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了未感染和感染的細(xì)胞之間VOC濃度的顯著差異?；撔枣溓蚓臃N后，乙醛和丙醛的排放增加反映出存在細(xì)菌感染，而乙酸正丙酯與病毒感染有關(guān)。Abd El Qader等[39]報(bào)道，一項(xiàng)包含5種病毒(甲、乙型流感病毒，腺病毒，呼吸道合胞病毒和1型副流感病毒)和3種細(xì)菌(卡他拉莫菌、流血嗜血桿菌和嗜肺軍團(tuán)菌)的體外實(shí)驗(yàn)中通過(guò)GC-MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：18種VOC與鑒定的病毒和細(xì)菌相關(guān)，其中1-己醇僅與病毒相關(guān)，而1-十七烯與細(xì)菌相關(guān)。Traxler等[40]從感染了甲型流感病毒的豬的呼吸中觀察到，呼出氣中的乙醛、丙醛、乙酸正丙酯、甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯和1,1-二丙氧基丙烷在感染期間增加，感染后下降。他們使用針阱微萃取結(jié)合GC-MS法來(lái)區(qū)分感染豬和未感染豬。基于培養(yǎng)頂空提取，他們還報(bào)告了病毒感染細(xì)胞中乙酸正丙酯水平高于細(xì)菌感染細(xì)胞[38]。Purcaro等[41]從接種了甲型流感病毒和呼吸道合胞病毒的人喉部細(xì)胞的培養(yǎng)液中進(jìn)行了VOC提取，并發(fā)現(xiàn)了VOC(甲型流感中的丙酮、正己烷和其他未知分子；呼吸道合胞病毒中的2-甲基戊烷、甲基砜、2,4-二甲基庚烷和4-甲基辛烷)可以有效區(qū)分感染和未感染的細(xì)胞。

(二)真菌感染

Telagathoti等[42]報(bào)道，針對(duì)來(lái)自高山環(huán)境中的13種被孢霉，使用PTR-MS技術(shù)在其VOC中檢測(cè)到了139個(gè)質(zhì)譜峰，即使僅根據(jù)高濃度的質(zhì)譜峰也能清楚地區(qū)分出各種霉菌。每種霉菌并沒(méi)有特異性VOC，但是不同菌種之間VOC的相對(duì)濃度有所不同。Gerritsen等[43]在對(duì)體外培養(yǎng)曲霉菌臨床分離株的研究中發(fā)現(xiàn)，VOC可用于臨床分離株的鑒定，但這些VOC譜無(wú)法在侵襲性肺曲霉菌病患者的呼出氣中得到證實(shí)。Koo等[44]利用熱解吸和GC-MS法，發(fā)現(xiàn)α和β-反式佛手柑油烯、β-朱欒倍半萜烯和反式香葉基丙酮對(duì)于診斷侵襲性肺曲霉菌病患者的敏感度為94%，特異度為93%。de Heer等[45]于2013年驗(yàn)證了可通過(guò)eNose分析呼出的VOC模式來(lái)診斷侵襲性肺曲霉菌病，而其2016年的研究旨在確定是否可以將霉菌與其他微生物區(qū)分開(kāi)，以及兩種不同霉菌之間是否可以區(qū)分。研究者在單獨(dú)的密閉瓶中培養(yǎng)了肺炎鏈球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、煙曲霉和米曲霉的菌株，eNose交叉驗(yàn)證的準(zhǔn)確度為92.9%(敏感度為95.2%，特異度為91.9%)，可將煙曲霉與細(xì)菌以及酵母菌區(qū)分開(kāi)，且在區(qū)分米曲霉和煙曲霉時(shí)具有100%的準(zhǔn)確度。王彤等[46]研究發(fā)現(xiàn)，肺隱球菌病和肺曲霉菌病患者的VOC之間差異并不顯著；2-甲基丙醛、異丙苯、4-甲基-2-戊酮和2-戊酮在兩種疾病中均能檢測(cè)到，而2-丁酮和3-戊酮在肺曲霉菌病中特異性更強(qiáng)，丁醛和己醛在肺隱球菌病中特異性更強(qiáng)。因此，建立真菌感染VOC圖譜可能更有利于檢測(cè)和鑒別其微生物種類。

(三)細(xì)菌感染

1.肺炎鏈球菌感染：Mellors等[47]報(bào)道，使用固相微萃取和TOF-MS評(píng)估了肺炎鏈球菌血清型的揮發(fā)性分子譜。在等基因背景中分析了7種血清型(6B、14、15、18C、19F、9V和23F)，研究者確定了與所有7個(gè)血清型相關(guān)的13個(gè)核心分子，以及在7個(gè)血清型之間產(chǎn)生差異的分子。發(fā)現(xiàn)血清型14具有最明顯的揮發(fā)性特征，可以與其他6種血清型區(qū)分開(kāi)來(lái)，曲線下面積(area under the curve，AUC)為89%，表明來(lái)自肺炎鏈球菌培養(yǎng)頂層空氣的分子顯示出快速血清型鑒定的潛力。van Oort等[48]在成年雄性大鼠氣管內(nèi)接種肺炎鏈球菌或銅綠假單胞菌，同時(shí)對(duì)照組用生理鹽水處理，24 h后進(jìn)行機(jī)械通氣，提取呼吸中的VOC，并使用GC-MS和SIFT-MS分析這些化合物。在GC-MS結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)了8種可以區(qū)分感染和未感染動(dòng)物的化合物(4-甲基辛烷、2,5-二甲基辛烷、四氯乙烯、一種未知的萘化合物、2種未知的環(huán)化合物、未知的支鏈醛，以及另一種未知化合物)，AUC為0.93；14種化合物能夠區(qū)分肺炎鏈球菌和對(duì)照組(4-甲基辛烷、2,5-二甲基辛烷、十六烷、2,4-二甲基正己烷、1-甲氧基-2-丙醇、2-甲基壬烷、2,4-二甲基庚烷、2種未知的環(huán)化合物、一種未知的萘化合物、4種其他未鑒定化合物)，AUC為0.93；3種化合物能夠區(qū)分銅綠假單胞菌與對(duì)照組(2-丙烯酸-2-乙基己酯、未鑒定的支鏈醛和一種未鑒定的環(huán)狀化合物)，AUC為0.98；肺炎鏈球菌對(duì)銅綠假單胞菌的AUC為0.99。這些結(jié)果支持在細(xì)菌性肺炎中建立物種特異性細(xì)菌譜的潛力。基于呼出氣VOC的細(xì)菌性肺炎檢測(cè)是一種潛在診斷方法，樣品收集相對(duì)簡(jiǎn)單，能夠從氣道和肺實(shí)質(zhì)獲取微生物VOC，然而許多細(xì)菌VOC特征尚未在大規(guī)模臨床研究中得到充分驗(yàn)證。因此，需要使用標(biāo)準(zhǔn)化儀器和標(biāo)準(zhǔn)化方法很好地建立每種細(xì)菌的VOC特征，以確保潛在的臨床轉(zhuǎn)化[49]。

2.肺結(jié)核：結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)檢查陽(yáng)性是診斷肺結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)[50]，但目前的病原學(xué)診斷技術(shù)并不理想，肺結(jié)核診斷技術(shù)仍存在不夠準(zhǔn)確、價(jià)格昂貴或流程復(fù)雜等問(wèn)題[51]。因此迫切需要一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法來(lái)診斷肺結(jié)核，而呼出氣VOC檢測(cè)因具有無(wú)創(chuàng)、取樣簡(jiǎn)單等特點(diǎn)而備受關(guān)注[52]。Phillips等[53]對(duì)肺結(jié)核患者呼出氣和體外培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌菌株VOC進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，二者存在兩種相似成分；他們采用12種VOC構(gòu)建分類模型進(jìn)行肺結(jié)核診斷，敏感度和特異度均為100%，但該研究?jī)H納入42例肺結(jié)核患者。隨后，在其中一項(xiàng)包含226例活動(dòng)性肺結(jié)核患者的研究中，Phillips等[54]鑒定出了10種標(biāo)志性VOC[3-(1-甲基乙基)-氧乙烷、4-甲基十二烷、乙基環(huán)己烷、鄰苯二甲酸二(3,5,5-三甲基己基)酯、1,3,5-三甲苯、3,7-二甲基癸烷、十三烷、4,6,8-三甲基-1-壬酮、5-乙基-2-甲基庚烷、4-甲基-1-己烯]；并以10種VOC構(gòu)建的診斷模型在診斷活動(dòng)性肺結(jié)核方面準(zhǔn)確率達(dá)到85%，敏感度和特異度分別為84%和64.7%。Phillips等[55]在另一項(xiàng)130例活動(dòng)性肺結(jié)核和121例對(duì)照者的研究中，鑒定出8種VOC可作為生物標(biāo)志物，其中4種(萘、苯和烷烴衍生物)為之前鑒定的氧化應(yīng)激和結(jié)核分枝桿菌代謝產(chǎn)物；以8種VOC作為標(biāo)記，使用6分鐘即時(shí)呼出氣VOC檢測(cè)識(shí)別肺結(jié)核患者時(shí)，準(zhǔn)確率為80%，敏感度和特異度分別為71.2%和72%。Syhre和Chambers[56]使用GC-MS從體外培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌中鑒定出4種VOC(苯乙酸甲酯、對(duì)甲基苯甲酸甲酯、煙酸甲酯和鄰甲氧基聯(lián)苯)。隨后，Syhre等[57]選擇煙酸甲酯進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證，使用GC-MS分析肺結(jié)核患者呼出氣中的VOC，發(fā)現(xiàn)痰涂片陽(yáng)性的肺結(jié)核患者的煙酸甲酯水平高于不吸煙的健康者，但仍需進(jìn)一步驗(yàn)證吸煙對(duì)煙酸甲酯的影響。而B(niǎo)hatter等[58]通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘和分析提出了苯乙酸甲酯、煙酸甲酯和茴香酸甲酯的生物合成途徑，并確定了腺苷蛋氨酸在酸的酯化過(guò)程中的重要作用。

Kolk等[59]在一項(xiàng)包含50例肺結(jié)核患者和50例非肺結(jié)核患者的研究中，使用GC-MS檢測(cè)患者呼出氣，以7種VOC(十二烷、3-七氟丁酰氧基十五烷、5-己烯酸、2-乙基己醇、肉豆蔻酸、辛醛和一種未知化合物)構(gòu)建的分類模型在鑒別肺結(jié)核和非肺結(jié)核患者時(shí)準(zhǔn)確率為79%，敏感度和特異度分別為72%和86%。隨著研究的不斷進(jìn)展，Beccaria等[60]使用TOF-MS分析14例活動(dòng)性肺結(jié)核和20名對(duì)照者的呼出氣VOC，篩選出了22種VOC組成了特征性圖譜。Küntzel等[61]使用GC-MS分析樣品，在13種不同分枝桿菌培養(yǎng)容器的頂空中鑒定出130余種VOC，揭示了11種分枝桿菌的物種特異性VOC譜，并鑒定出了17種物質(zhì)作為整體正在生長(zhǎng)的結(jié)核分枝桿菌的潛在生物標(biāo)記。Mellors等[62]在一項(xiàng)對(duì)獼猴的研究中發(fā)現(xiàn)了4-(1,1-二甲基丙基)苯酚和4-乙基-2,2,6,6-四甲基庚烷這兩種新的VOC，在這之前這兩種VOC與肺結(jié)核并不相關(guān)；他們還識(shí)別出了38種明顯差異的VOC，用以區(qū)分罹患了肺結(jié)核的獼猴和健康的獼猴，其AUC為0.98；且在培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌VOC中能檢測(cè)到37種VOC。Bobak等[63]鑒定出4種化合物(癸烷、4-甲基辛烷和2種未知的分析物)，以80%的敏感度和100%的特異度將10例肺結(jié)核確診患者與10例非結(jié)核下呼吸道感染患者區(qū)分開(kāi)來(lái)；并且在11例臨床高度懷疑肺結(jié)核患者(痰培養(yǎng)或GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果為陰性)的呼出氣中也發(fā)現(xiàn)了這4種VOC。Lim等[64]研究發(fā)現(xiàn)，傘花烴、3-戊醇和對(duì)甲基苯乙烯含量在肺結(jié)核患者尿液中較低，鄰二甲苯和乙酸異丙酯含量較高，這與2020年的一項(xiàng)研究結(jié)果類似，Nol等[65]通過(guò)質(zhì)譜分析成年野豬呼出的VOC發(fā)現(xiàn)，與未感染的野豬相比，傘花烴的含量在感染了結(jié)核分枝桿菌的野豬中更低。綜上所述，盡管還需要更大規(guī)模的研究來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證，但VOC顯示出了診斷結(jié)核病的希望。

結(jié)核分枝桿菌中常見(jiàn)的VOC為烷烴及其衍生物和苯及其衍生物，如傘花烴、4-甲基十二烷、煙酸甲酯及鄰甲氧基聯(lián)苯等[66]。烷烴及其衍生物被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的產(chǎn)物[54]，在肺部感染性疾病中比較常見(jiàn)。盡管在呼出氣VOC方面取得了眾多的進(jìn)展，但至今尚未有公認(rèn)的某一種VOC或某種VOC圖譜用于結(jié)核分枝桿菌的鑒定或結(jié)核病的診斷。且不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果VOC圖譜差異較大。如Beccaria等[60]與Phillips等[54]均檢測(cè)了活動(dòng)性肺結(jié)核患者呼出氣VOC，但二者的結(jié)果中僅2-丁基-1-辛醇是共有的。患者呼出氣和體外培養(yǎng)菌株VOC之間也存在差異。如Phillips等[53]對(duì)肺結(jié)核患者呼出氣和體外培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌菌株VOC進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的菌株檢測(cè)到130種不同的VOC，其中2種在肺結(jié)核患者呼出氣VOC中能檢測(cè)到。且不同的體外培養(yǎng)基檢測(cè)到的結(jié)核分枝桿菌的VOC也有差異[67]。此外，結(jié)核分枝桿菌VOC與上述的細(xì)菌、真菌和病毒感染的VOC也存在異同。肺炎鏈球菌VOC中較常見(jiàn)的為醇類、醛類、酮類和酯類，但部分VOC在結(jié)核分枝桿菌中也能檢測(cè)到，如煙酸甲酯、鄰甲氧基聯(lián)苯[56,67]。肺曲霉菌病患者呼出氣VOC中萜類化合物較常見(jiàn)[44]，而肺隱球菌病患者呼出氣VOC中酮類和醛類物質(zhì)較多[46]，但二者均含結(jié)核分枝桿菌中常見(jiàn)的烷烴、苯及其衍生物，如異丙苯[46]。病毒感染者的VOC中醛類和酮類較多，但也存在一些烷烴類物質(zhì)，如癸烷和正己烷[34,40]。

(四)目前存在的問(wèn)題

無(wú)創(chuàng)、取樣簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)使得呼出氣VOC檢測(cè)在臨床實(shí)踐中的采用成為一個(gè)有吸引力的前景。然而，呼出氣檢測(cè)的臨床應(yīng)用面臨較多挑戰(zhàn)和障礙。比如，既往大多數(shù)已發(fā)表的呼吸研究都是在疾病穩(wěn)定狀態(tài)或門診水平下進(jìn)行的，需要針對(duì)急性疾病狀態(tài)的進(jìn)一步大規(guī)模試驗(yàn)來(lái)評(píng)估其可靠性和可重復(fù)性。還有一些關(guān)鍵混雜因素對(duì) VOC 診斷準(zhǔn)確性的影響，包括一些內(nèi)部因素(如藥物治療強(qiáng)度、種族和性別)和外部因素(如飲食和環(huán)境)等。如何處理呼吸樣本中存在大量的外源性化合物(即環(huán)境污染)是呼吸VOC研究的一個(gè)基本問(wèn)題，外源性VOC不斷被引入呼吸系統(tǒng)，由于氣體交換的復(fù)雜動(dòng)力學(xué)，這些氣體可以通過(guò)與氣道微生物群和黏膜內(nèi)層的各種相互作用，從而導(dǎo)致?lián)]發(fā)性副產(chǎn)物的產(chǎn)生，可能影響呼吸中代謝物的濃度和成分。因此，在分析呼出氣VOC時(shí)，應(yīng)特別考慮外源性VOC和環(huán)境污染。呼出氣檢測(cè)肺部感染性疾病仍然是一個(gè)具有很大不確定性的領(lǐng)域，其診斷準(zhǔn)確性需要更大規(guī)模的、設(shè)計(jì)良好的研究數(shù)據(jù)支撐。

五、總結(jié)與展望

呼出氣VOC分析是評(píng)估個(gè)體健康或疾病狀況的一種無(wú)創(chuàng)和無(wú)痛的檢測(cè)方法，并為臨床試驗(yàn)、診斷和監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)的方式提供支持，并且有可能改善病理生理過(guò)程的識(shí)別，特別是感染性疾病，因?yàn)槲⑸镉性S多不同于人體代謝的獨(dú)特代謝途徑。盡管在嚴(yán)格識(shí)別和驗(yàn)證VOC以區(qū)分感染和非感染患者方面存在許多技術(shù)挑戰(zhàn)，但呼出氣VOC檢測(cè)仍然具有很大前景。這些基于呼出氣VOC的檢測(cè)將比現(xiàn)有方法更早地提供無(wú)創(chuàng)、快速、實(shí)時(shí)的特定感染識(shí)別，一方面使患者獲得早期、適當(dāng)?shù)目垢腥局委?，另一方面能減少不必要的抗生素暴露，并最終改善這些患者的臨床結(jié)局。隨著近年來(lái)精密分析儀器的出現(xiàn)及改進(jìn)，即時(shí)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在能在超痕量水平上識(shí)別和量化揮發(fā)性分析物，并進(jìn)一步鑒定生物標(biāo)志物，準(zhǔn)確識(shí)別特定肺部感染性疾病。相信在不久的未來(lái)，基于肺部感染性疾病診斷的VOC檢測(cè)很可能在臨床上得到驗(yàn)證和推廣應(yīng)用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突