張 三 唐姍姍

1.新鄭市人民醫(yī)院科檢驗科 (河南 新鄭 451100)

2.新鄭市城關(guān)鄉(xiāng)衛(wèi)生院檢驗科 (河南 新鄭 451100)

結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)感染可引發(fā)結(jié)核病，對患者生命安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。近年來，結(jié)核病發(fā)病率逐年上升，小部分結(jié)核病患者病情進(jìn)展為利福平耐藥結(jié)核，而大部分患者發(fā)展為多重耐藥結(jié)核，給治療增加難度[1]?，F(xiàn)階段，臨床對于MTB的檢測主要依靠藥物敏感度試驗及結(jié)核菌培養(yǎng)等，雖該方法準(zhǔn)確性好且操作成本較低，但培養(yǎng)周期較長，在此期間內(nèi)易延誤患者最佳治療時機(jī)[2]。隨著醫(yī)療技術(shù)的快速發(fā)展，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)法在臨床上的應(yīng)用具有檢測速度快、檢查成本低等特點，可為臨床診斷MTB耐藥提供可靠依據(jù)[3]。鑒于此，本研究采用實施熒光定量PCR法分析MTB耐藥性，旨在探究其臨床應(yīng)用價值?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2018年10月至2020年11月我院收治的結(jié)核病患者84例，均符合《肺結(jié)核診斷和治療指南》[4]中疾病相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，本研究獲倫理委員會批準(zhǔn)。其中男45例，女39例；年齡19～69歲，平均年齡(44.58±3.61)歲。

1.2 方法(1)核酸提?。簩?0L核酸提取液加入核酸提取試管中，刮取少量菌落轉(zhuǎn)移至試管中，在核酸快速提取儀下振蕩10min，并將其置于95℃金屬浴內(nèi)10min，隨后取出并離心處理1min獲得核酸，用于擴(kuò)增操作。(2)檢測準(zhǔn)備及原理：對利福平、鏈霉素、異煙肼、阿米卡星、乙胺丁醇、莫西沙星等藥物的耐藥狀況進(jìn)行分析。按照待檢測樣本數(shù)量的5倍，準(zhǔn)備200L平蓋PCR薄壁管，分別從試劑盒中提取擴(kuò)增反應(yīng)液A/B/C/D/E，徹底融化后漩渦震蕩。按照每管25L分裝各擴(kuò)增反應(yīng)液至PCR薄壁管中，隨后將其轉(zhuǎn)移至PCR模板加樣區(qū)。向每個樣品中加入同一模板DNA 5L，保證每管總體積為30L。(3)PCR擴(kuò)增及結(jié)果的判斷：將PCR反應(yīng)管置于熒光PCR儀中，行擴(kuò)增操作，檢測結(jié)果由MTB耐藥基因檢測分析系統(tǒng)進(jìn)行輔助的判讀。

1.3 觀察指標(biāo)以羅氏藥敏比例法作為檢測MTB耐藥性的“金標(biāo)準(zhǔn)”，分析FQ-PCR法在MTB耐藥性中的應(yīng)用價值，包括靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值。以n表示總例數(shù)，a表示真陽性，b表示假陽性，c表示假陰性，d表示真陰性。靈敏度=a/(a+c)，特異度=d/(b+d)，準(zhǔn)確度=(a+d)/n，陽性預(yù)測值=a/(a+b)，陰性預(yù)測值=d/(c+d)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗，F(xiàn)Q-PCR法診斷MTB耐藥性與羅氏藥敏比例法檢查結(jié)果的一致性使用kappa檢驗，kappa值≥0.75表示一致性良好，0.4～0.74表示一致性尚可，＜0.4表示一致性不佳；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

FQ-PCR法分析MTB耐藥性中各藥物靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；而準(zhǔn)確度及陰性預(yù)測值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。kappa檢驗顯示：對阿米卡星檢測一致性不佳(kappa值為0.279)；對利福平、異煙肼、莫西沙星及乙胺丁醇一致性尚可(kappa值分別為0.637、0.631、0.578、0.623)；對鏈霉素一致性良好(kappa值為0.815)。

表1 FQ-PCR法在MTB耐藥性分析中的應(yīng)用價值

3 討 論

現(xiàn)階段，臨床對于結(jié)核病的治療主要采用藥物的方式，通常采用一線及二線抗癆藥物聯(lián)合使用，其中一線抗癆藥物包括利福平、鏈霉素、乙胺丁醇、異煙肼，可取得一定的效果，安全性高[5-6]。而二線抗癆藥物包括氟喹諾酮類、阿米卡星、卡那霉素類藥物，但單純用藥存在較高的風(fēng)險，加之不規(guī)則的錯誤的化療，使得藥物耐藥性大大上升，患者治療依從性明顯下降[7-8]。故對上述抗結(jié)核藥物耐藥性行積極的管理有助于更好的給出治療方案指導(dǎo)臨床治療。

既往傳統(tǒng)培養(yǎng)法在藥敏結(jié)果檢測中耗時較長，易延誤患者治療時機(jī)。近年來，分子診斷技術(shù)在MTB耐藥檢測中得到廣泛應(yīng)用，MTB耐藥的產(chǎn)生是因自身基因突變而導(dǎo)致[9]。因此，對某些基因片段發(fā)生突變在耐藥菌株中占較大比例時，可通過對基因片段進(jìn)行檢測判斷該菌株的耐藥情況。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)Q-PCR法分析MTB耐藥性中各藥物靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而準(zhǔn)確度及陰性預(yù)測值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。kappa檢驗顯示：對阿米卡星檢測一致性不佳(kappa值為0.279)；對利福平、異煙肼、莫西沙星及乙胺丁醇一致性尚可(kappa值分別為0.637、0.631、0.578、0.623)；對鏈霉素一致性良好(kappa值為0.815)，提示FQ-PCR法在MTB耐藥性診斷中應(yīng)用價值較高，能夠檢出MTB對藥物的耐藥性，且一致性較強(qiáng)。究其原因可知FQ-PCR法具有檢測時間短、成本低、藥物檢測種類多等優(yōu)勢，能夠有效避免PCR污染等導(dǎo)致檢測結(jié)果差異等問題。本研究中FQ-PCR法對阿米卡星耐藥性檢出一致性不佳，較好說明該基因型檢測位點的耐藥監(jiān)測準(zhǔn)確性不高，或存在其他的耐藥基因位點的突變。另該方法對其他藥物耐藥性檢測雖靈敏度不高，或存在耐藥表型與基因型存在差異，可能與MTB表型耐藥不穩(wěn)定而發(fā)生改變相關(guān)，亦或與部分突變?yōu)闊o意義突變等不會對MTB耐藥性造成影響[10]。

綜上所述，實施熒光定量PCR法在MTB耐藥性檢測中應(yīng)用價值較高，具有較好的應(yīng)用前景，可為臨床用藥提供指導(dǎo)，值得推廣。