羅濤，劉永芳，劉方燕，付湘云，劉志剛

膿毒癥是由宿主對感染反應(yīng)失調(diào)引起的威脅生命的疾病。膿毒癥相關(guān)腦?。╯epsis associated encephalopathy，SAE）是膿毒癥常見但研究較少的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，其臨床表現(xiàn)可能從譫妄到認(rèn)知障礙或深度昏迷等[1]。研究表明，膿毒癥期間系統(tǒng)性產(chǎn)生的內(nèi)毒素和促炎細(xì)胞因子可導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞和腦內(nèi)皮細(xì)胞活化、緊密連接蛋白下調(diào)和白細(xì)胞募集增加，由此產(chǎn)生的神經(jīng)炎癥和血腦屏障（blood brain barrier，BBB）損傷可加重膿毒癥引起的腦功能障礙[2]。丙泊酚是臨床最常用的靜脈麻醉藥，除鎮(zhèn)靜、催眠作用外，還具有抗炎、抗凋亡和抗氧化等作用。有報道丙泊酚可通過抑制肝臟氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化和炎癥反應(yīng)，改善膿毒癥引起的肝功能障礙[3]。但丙泊酚對膿毒癥引起的BBB損傷是否有保護(hù)作用，目前尚不清楚。本實驗擬探究丙泊酚對膿毒癥小鼠BBB損傷的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.1.1 實驗動物 雄性SPF級C57BL/6小鼠[實驗動物質(zhì)量合格證SCXK(鄂)2017-0012]30只，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物實驗中心提供。飼養(yǎng)溫度22℃～25℃，濕度50%～60%，晝夜交替光照，小鼠自由食水。本實驗經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物實驗倫理委員會審核批準(zhǔn)（編號：WDRM20191004）。

1.1.2 主要試劑 脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）O111:B4（批號L2630）購于美國Sigma公司；丙泊酚注射液（批號RJ816）購于英國AstraZenec公司；小鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）（ml063810）和小鼠S100βELISA試劑盒（ml037988）購于上海酶聯(lián)生物科技公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0012）購于上海碧云天生物科技公司；兔源閉合蛋白（Occludin）一抗、兔源密封蛋白（Claudin）-5一抗（A10207）、兔源基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9一抗（A2607）和HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（AS014）購于武漢ABclonal公司；兔源β-actin一抗，RIPA裂解液購于武漢Servicebio公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型制備 將小鼠按體質(zhì)量編號，采用隨機數(shù)字法將其分為對照（Con）組、膿毒癥（LPS）組和丙泊酚（propofol，PF）組。LPS組和PF組小鼠采用腹腔注射LPS（10 mg/kg）制備膿毒癥小鼠模型，注射LPS后的即刻和6 h后給PF組小鼠腹腔注射丙泊酚（50 mg/kg），給LPS組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水；Con組僅給予腹腔注射等體積的生理鹽水。給藥后放入籠中觀察小鼠精神及活動狀態(tài)。

1.2.2 小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分 各組完成給藥24 h后觀察小鼠行為學(xué)變化，參考文獻(xiàn)[4]，分別采用耳廓反射、捏尾反射、角膜反射、逃避反射、翻正反射對小鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分：每項正常為2分，反射減弱（5 s＜間隔時間≤10 s）為1分，反射喪失（間隔時間＞10 s）為0分；評分最高為10分，分?jǐn)?shù)越低說明神經(jīng)系統(tǒng)損傷越嚴(yán)重。

1.2.3 血生化指標(biāo)檢測 各組完成給藥24 h后，每組隨機選取4只小鼠，麻醉狀態(tài)下于心尖部取血約0.5～1.0 mL，常溫下3500 r/min離心10 min，吸取上清液。采用ELISA法檢測血清NSE和S100β水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 腦組織含水量和BBB通透性測定 各組完成給藥24 h后，每組隨機選取4只小鼠，尾靜脈注射2%伊文氏藍(lán)（Evans blue，EB）（3 mL/kg）。2 h后麻醉小鼠，于左心室灌注0.9%生理鹽水取腦，分離左側(cè)腦組織并稱重，放入盛有甲酰胺的離心管中，于37℃水浴48 h，3000 r/min離心15 min后取上清液，采用酶標(biāo)儀于波長632 nm處檢測其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算腦組織EB含量。分離右側(cè)腦組織，濾紙吸干多余水分和血液，稱量濕重，置于80℃烤箱內(nèi)烘烤48 h至恒重，取出后稱干重，腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.3 腦組織Occludin、Claudin-5和MMP-9蛋白表達(dá)水平 將各組完成取血進(jìn)行生化檢測的小鼠處死后，剝離并稱取適量大腦皮質(zhì)，提取總蛋白，BCA法檢測樣品蛋白濃度；常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗兔抗Occludin、Claudin-5、MMP-9（1∶1000稀釋），4℃孵育過夜；TBST緩沖液洗3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶5000稀釋），室溫孵育1 h；TBST緩沖液洗3次后，使用ECL顯影液顯影。采用Image J軟件分析光密度值，以目的蛋白光密度值與內(nèi)參蛋白β-actin光密度值的比值反映目的蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 26.0軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布以及方差齊性的計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗；若方差不齊則使用Tamhane’s T2檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分

給藥24 h后，小鼠出現(xiàn)豎毛、呼吸急促、眼角膿性分泌物、厭食和反應(yīng)遲鈍等表現(xiàn)。Con組、LPS組和PF組小鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分分別為（9.42±0.67）分、（5.75±1.06）分和（7.17±0.83）分，LPS組和PF組均低于Con組（均P＜0.05）；PF組高于LPS組（P＜0.05）。

2.2 各組小鼠血清NSE和S100β水平

與Con組相比，LPS組血清NSE和S100β明顯升高（P＜0.05）；與LPS組比較，PF組血清NSE和S100β明顯降低（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠血清NSE和S100β水平比較（±s）

注：與Con組比較，①P＜0.05；與LPS組比較，②P＜0.05

組別Con組LPS組PF組F值P值只數(shù)444 NSE/(ng/mL)1.01±0.03 5.20±0.13①3.22±0.09①②1952.00 P＜0.01 S100β/(pg/mL)65.70±5.51 167.07±5.68①114.57±5.66①②325.80 P＜0.01

2.3 各組小鼠腦含水量和BBB通透性

與Con組比較，LPS組小鼠腦含水量和EB含量明顯增加（P＜0.05）；與LPS組比較，PF組小鼠腦含水量和EB含量明顯減少（P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠腦含水量和EB含量（±s）

表2 各組小鼠腦含水量和EB含量（±s）

注：與Con組比較，①P＜0.05；與LPS組比較，②P＜0.05

組別Con組LPS組PF組F值P值只數(shù)444含水量/%75.76±1.25 78.92±0.98①76.32±0.43②12.66 P＜0.01 EB含量/(μg/mL)2.08±0.08 5.92±0.23①3.63±0.24①②374.00 P＜0.01

2.4 各組小鼠腦組織Occludin、Claudin-5和MMP-9蛋白表達(dá)水平

與Con組比較，LPS組小鼠MMP-9表達(dá)增加，Occludin和Claudin-5明顯減少（P＜0.05）；與LPS組比較，PF組MMP-9明顯下調(diào)，Occludin和Claudin-5表達(dá)增加（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組小鼠腦組織Occludin、Claudin-5和MMP-9蛋白表達(dá)量

3 討論

膿毒癥發(fā)生時，全身感染誘導(dǎo)不受控制的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致全身多器官功能障礙，大腦是最早受到影響的器官之一。NSE和S100β是神經(jīng)系統(tǒng)損傷的特異性血清標(biāo)志物，臨床研究表明，膿毒癥合并腦功能障礙患者血清NSE和S100β濃度增加[5]。本研究參照文獻(xiàn)，采用腹腔注射LPS制備膿毒癥腦損傷小鼠模型[6]。給藥24 h后，小鼠出現(xiàn)豎毛、呼吸急促、眼角膿性分泌物、厭食和反應(yīng)遲鈍等表現(xiàn)，神經(jīng)行為學(xué)評分減低，血清NSE和S100β明顯升高，表明膿毒癥腦損傷模型制備成功。參照文獻(xiàn)[7]，給予膿毒癥小鼠丙泊酚后，小鼠活動增加、呼吸減慢、膿性分泌物減少、攝食飲水增多，神經(jīng)行為學(xué)評分增高，血清NSE和S100β降低，表明丙泊酚可減輕膿毒癥小鼠腦損傷[7]。

BBB是腦內(nèi)具有高度選擇性的神經(jīng)血管單元，由腦內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等構(gòu)成，能限制血液和大腦之間的離子和液體運動，為大腦提供必需的營養(yǎng)素，排出代謝廢物，有助于維持大腦微環(huán)境的內(nèi)環(huán)境平衡[8]。其中，血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接是限制物質(zhì)轉(zhuǎn)運的物理結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，Occludin和Claudin-5作為組成緊密連接復(fù)合體的關(guān)鍵跨膜蛋白，其結(jié)構(gòu)和功能的改變可導(dǎo)致緊密連接解離，引起細(xì)胞間隙和血管通透性增加[9]。本研究采用干濕比重法和EB法檢測膿毒癥小鼠BBB的通透性，并檢測緊密連接蛋白Occludin和Claudin-5表達(dá)量。EB是一種與血清白蛋白結(jié)合的堿性染料，正常情況下無法通過血管。當(dāng)BBB破壞時，EB可滲透進(jìn)入腦組織，其在腦內(nèi)的含量可反映BBB的通透性。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥小鼠BBB通透性增加，Occludin和Claudin-5表達(dá)降低，而丙泊酚能降低膿毒癥小鼠BBB通透性，增加緊密連接蛋白Occludin和Claudin-5表達(dá)量。

目前關(guān)于膿毒癥導(dǎo)致BBB損傷的機制尚不完全清楚。有研究報道，膿毒癥時免疫細(xì)胞激活，分泌大量TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥介質(zhì)，破壞內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接，導(dǎo)致微血管滲漏和組織水腫[10]。內(nèi)毒素LPS可能通過增強Caspase-3/7和Bax活性，抑制Bcl-2和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitricoxide synthase，eNOS），促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡從而損害BBB功能[11]。另外，動力相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）介導(dǎo)的線粒體功能障礙也是BBB損傷的重要機制之一。Drp1抑制劑P110可減輕膿毒癥誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)并提高線粒體膜電位，保護(hù)BBB完整性[12]。MMPs是一類鋅依賴的蛋白水解酶，MMP-9作為主要的效應(yīng)分子，可降解細(xì)胞外基質(zhì)中IV膠原，損傷BBB。已有研究證實膿毒癥大鼠BBB通透性的增加與腦微血管中高水平的MMP-9有關(guān)，特異性抑制MMP-9可降低BBB通透性，改善認(rèn)知功能障礙[13]。

丙泊酚作為最常用的靜脈麻醉劑之一，具有起效快、作用時間短、消除快，且副作用少等優(yōu)點，廣泛用于手術(shù)患者的麻醉和重癥監(jiān)護(hù)病房患者的鎮(zhèn)靜。除鎮(zhèn)靜作用外，據(jù)報道丙泊酚能通過激活GABAA受體和誘導(dǎo)Nrf2的核移位，在M1型巨噬細(xì)胞極化期間抑制IL-6和IL-1β表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)[14]。此外，丙泊酚可以下調(diào)TLR4/NF-κB信號，同時抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表達(dá)，減輕亞硝化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[15]。Xie等[16]發(fā)現(xiàn)，丙泊酚能抑制MMP-9和NF-κB表達(dá)，上調(diào)Occludin和Claudin-5，維持缺血再灌注后血脊髓屏障的完整性。但丙泊酚能否通過調(diào)節(jié)MMP-9而減輕膿毒癥誘導(dǎo)的BBB損傷，尚未見相關(guān)報道。本實驗結(jié)果顯示，膿毒癥小鼠腦組織MMP-9上調(diào)，BBB通透性增加，而丙泊酚能降低MMP-9蛋白水平，保護(hù)BBB完整性，提示丙泊酚可能通過抑制MMP-9表達(dá)進(jìn)而減輕膿毒癥誘導(dǎo)的BBB損傷。丙泊酚對血腦屏障的保護(hù)作用有望為臨床上膿毒癥腦損傷患者的治療提供新的思路，未來仍需大量研究以進(jìn)一步分析其具體的作用機制。

綜上所述，丙泊酚可改善膿毒癥小鼠血腦屏障損傷，降低血腦屏障通透性，其機制可能與抑制MMP-9表達(dá)有關(guān)。