孫淼淼，劉凱，王瞳，邱森，趙志華，陳奎生

0 引言

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是血液系統(tǒng)B淋巴細(xì)胞惡性增殖性疾病，發(fā)病率在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中排列第二，其中65歲以上的老年人占發(fā)病人數(shù)的2/3[1-2]。隨著我國人口老齡化，MM患病人數(shù)也逐年增多。盡管骨髓瘤靶向治療和免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用使預(yù)后有了很大改善，但至今仍無法治愈[3]。對于MM而言，單純地以骨髓瘤細(xì)胞為靶點治療，效果并不理想。

研究發(fā)現(xiàn)，同其他系統(tǒng)腫瘤一樣，MM的發(fā)生和發(fā)展也需要血管生成[4]。腫瘤血管生成是一個多步驟、多種生物成分參與的復(fù)雜過程[5]。RhoC作為Rho GTP酶家族中重要成員，參與惡性腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移及血管生成[6-7]，是一個備受關(guān)注的腫瘤治療潛在靶點。前期研究發(fā)現(xiàn)，RhoC在血管內(nèi)皮中表達，可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為并影響血管的生成[8]；下調(diào)骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞中RhoC表達，不僅可抑制移植瘤的生長，對腫瘤血管的生成也有抑制作用[9]。腫瘤血管是腫瘤靶向治療的重要目標(biāo)，腫瘤細(xì)胞可分泌高水平的促血管生成因子形成異常的血管網(wǎng)絡(luò)，反過來，腫瘤血管系統(tǒng)的異?；瘜δ[瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為也有重要影響[10]。

目前，已有研究主要以骨髓瘤細(xì)胞為靶點進行傳統(tǒng)的抗血管生成治療，但效果不能令人滿意。本研究將探討下調(diào)骨髓瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞（myeloma vascular endothelial cells,MVECs）中RhoC表達對骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，進一步研究其可能機制，以期為臨床骨髓瘤治療和研究提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑

RhoC shRNA慢病毒載體購自蘇州吉瑪基因公司；RhoC抗體購自英國Abcam公司；CDK、CyclinD1、AKT、PI3K、MMP2、MMP9抗體購自美國Proteintech公司；Transwell小室購自美國Corning公司；PI染色試劑盒購自江蘇凱基生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；Matrigel膠購自美國BD公司；Polybrene購自上海翊圣生物科技有限公司；本實驗室保存的MVECs、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）、骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞；DMEM、RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與條件培養(yǎng)基收集

MVECs和HUVECs使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長至對數(shù)期時用于后續(xù)實驗。

將MVECs和HUVECs按照每孔5×104個細(xì)胞加入24孔板中培養(yǎng)，24 h后將陰性對照組（NC組）和RhoC shRNA組（S組）慢病毒載體原液與細(xì)胞培養(yǎng)液按1:10稀釋，各孔加500 μl慢病毒稀釋液；12 h后更換新的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集條件培養(yǎng)基，離心、過濾、濃縮后用于培養(yǎng)骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞[11]。

1.3 RhoC shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染

將NC組和S組慢病毒載體原液（2×108TU/ml）與細(xì)胞培養(yǎng)液按1:10稀釋后加入2.5 μg聚凝胺，用于培養(yǎng)MVECs和HUVECs細(xì)胞，12 h后更換新鮮培養(yǎng)液，48 h后觀察慢病毒載體轉(zhuǎn)染效率，并用Western blot法驗證RhoC的表達變化[8]。

1.4 CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖能力

使用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞48 h后，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至每孔3×103個，每組3個復(fù)孔。CCK-8工作液與培養(yǎng)基按1:10稀釋后加入待測孔中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24、48、72、96 h后，使用酶標(biāo)儀在450 nm條件下檢測各組細(xì)胞OD值。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

將經(jīng)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的各組RPMI8226細(xì)胞收集、離心，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升2×106個，離心去上清液，使用70%的乙醇固定細(xì)胞，于4℃冰箱過夜。離心棄上清液，900 μl預(yù)冷PBS及50 μl RNA酶重懸細(xì)胞，37℃反應(yīng)30 min，然后加入5 μl PI試劑，37℃染色30 min；將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入流式管，上機檢測，每組細(xì)胞重復(fù)3次，根據(jù)Flow J軟件分析數(shù)據(jù)，得出G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞比例。

1.6 Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲能力

經(jīng)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的RPMI8226細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基饑餓處理24 h，取50 μl稀釋后的Matrigel膠加入小室，調(diào)整細(xì)胞密度為2×103個/孔后加入小室，向小室外加入含20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出小室固定染色。置于顯微鏡200倍視野下，隨機選取5個視野，計數(shù)小室膜下細(xì)胞數(shù)量，每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.7 Western blot實驗

將各組細(xì)胞在冰上裂解并提取蛋白質(zhì)，蛋白定量配平后，煮沸變性上樣，每孔10 μl，設(shè)置電壓80 V 30 min，120 V 60 min 進行電泳。電泳完成后，設(shè)置轉(zhuǎn)膜電壓80 V，90 min轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。然后添加一抗（RhoC、CDK、CyclinD1、AKT、PI3K、MMP2、MMP9），4℃過夜，次日添加HRP標(biāo)記的二抗，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，使用Image J軟件進行灰度定量分析。檢測慢病毒載體轉(zhuǎn)染MVECs和HUVECs后RhoC蛋白表達水平，以及NC組和S組骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞中CDK、CyclinD1、AKT、PI3K、MMP2、MMP9蛋白表達水平的差異，每組實驗重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件檢驗計量資料的正態(tài)性，將符合條件的計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩樣本之間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RhoC shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染情況

慢病毒載體轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況，MVECs和HUVECs細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均可達到80%以上，見圖1A；Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，慢病毒載體轉(zhuǎn)染MVECs和HUVECs細(xì)胞后，與NC組相比，S組RhoC蛋白表達量明顯降低（P=0.003、0.001），見圖1B。

2.2 條件培養(yǎng)基對骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8結(jié)果顯示：經(jīng)條件培養(yǎng)基對骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)4天后，與NC組相比，S組細(xì)胞增殖能力均明顯降低（P=0.004、0.006），見圖2。

2.3 條件培養(yǎng)基對骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期，見表1。與NC組相比，S組骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞數(shù)目明顯增加、S期細(xì)胞數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（MVECs:P=0.003、0.005;HUVECs:P=0.021、0.003）。

表1 條件培養(yǎng)基對骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞周期的影響 (%)Table 1 Effects of conditioned medium on cell cycle of myeloma RPMI8226 cells (%)

2.4 條件培養(yǎng)基對骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示：與NC組相比，S組骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞侵襲力明顯降低（45.33±9.45vs.109.33±14.36,67.67±9.71vs.122.33±7.09，P=0.003、0.001）。

2.5 Western blot法檢測骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞中蛋白表達情況

經(jīng)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞48 h后，Western blot法檢測骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞中CDK、CyclinD1、AKT、PI3K、MMP2、MMP9蛋白表達情況，與NC組相比，S組蛋白表達均降低（MVECs:P=0.023、0.003、0.015、0.001、0.034、0.021;HUVECs:P=0.035、0.005、0.021、0.002、0.025、0.032），見圖3、4。

3 討論

眾所周知，Rho GTPase通過激活下游多種效應(yīng)蛋白來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能。RhoC作為Rho GTPase家族的重要成員，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞黏附與遷移、惡性腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)功能[6,12-13]。RhoC高表達可促進結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，是預(yù)測結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)風(fēng)險的重要生物標(biāo)志物[14]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間可以相互作用，而RhoC在其中發(fā)揮重要作用[15]。腫瘤血管在腫瘤微環(huán)境中對腫瘤細(xì)胞的生長、增殖等過程起著重要作用，韓易等[16]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤血管不僅為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)，對腫瘤細(xì)胞的遷移能力也有重要影響。因此，本研究使用RhoC shRNA慢病毒載體下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中RhoC表達，收集條件培養(yǎng)基，觀察對骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。

惡性增殖是癌細(xì)胞的主要特征之一，細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期依賴性激酶（Cyclin dependent kinase,CDK）和細(xì)胞周期蛋白D（CyclinD1）等基因表達有關(guān)[17]，CDK和CyclinD1形成的蛋白激酶復(fù)合體共同推動了細(xì)胞周期的運行[18]。CyclinD1作為細(xì)胞周期蛋白家族成員，參與細(xì)胞周期的調(diào)控，使G1期細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镾期，與細(xì)胞生長關(guān)系較為密切[19]。本實驗結(jié)果顯示，干擾血管內(nèi)皮細(xì)胞中RhoC表達后，骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞的增殖和侵襲能力均受到抑制，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，同時細(xì)胞中CDK和CyclinD1蛋白表達也受到抑制，與陳佳琳等[20]研究結(jié)果相一致。程婧等[21]研究發(fā)現(xiàn)，乙酰輔酶A羧化酶1可通過調(diào)控CDK和CyclinD1表達促進腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖。然而本研究使用條件培養(yǎng)基調(diào)控骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞增殖的機制是否與乙酰輔酶A羧化酶1的表達改變參與調(diào)控有關(guān)，還有待進一步研究。

癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的過程復(fù)雜，影響因素眾多，其中基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs），尤其MMP2、MMP9活性增高，降解基底膜中Ⅳ型膠原是引起腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的重要因素[22-23]。Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，MMP2、MMP9在卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用，干擾MMP2、MMP9表達可抑制癌細(xì)胞侵襲和遷移。本研究Transwell實驗結(jié)果顯示，下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中RhoC表達后，骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯降低，侵襲能力受到抑制，與前者結(jié)論一致。此外，鄧文松等[25]研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA作為非編碼RNA在骨髓瘤細(xì)胞中高表達不但促進骨髓瘤細(xì)胞侵襲，也參與調(diào)控骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展。近年來，非編碼RNA受到廣泛關(guān)注，非編碼RNA與惡性腫瘤生物學(xué)行為及作用機制研究或?qū)⒊蔀樾碌难芯糠较颉?/p>

研究顯示，磷脂肌醇3-激酶（phosphoinositide-3 kinase,PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路作為細(xì)胞內(nèi)最重要的信號通路之一，對調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、生長、分化和細(xì)胞骨架重組等一系列信號做出反應(yīng)；該通路的異常激活存在于多種惡性腫瘤中，主要與腫瘤生長和血管生成有關(guān)[26]，且在不同癌種中RhoC對PI3K/AKT信號通路的影響不同，RhoC蛋白表達的變化可激活PI3K/AKT信號通路，引起癌細(xì)胞的增殖[27]。PI3K/AKT信號通路的異常激活可減少糖原的合成，增加糖酵解，通過N末端絲氨酸磷酸化抑制糖原合成酶激酶活性，增加CyclinD1的積累，從而促進細(xì)胞增殖[28]，因此抑制PI3K活性可取得有益的臨床治療效果。胡桂芳等[29]研究顯示，青蒿琥酯聯(lián)合亞砷酸通過抑制PI3K/AKT信號通路的活化而抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖。本實驗結(jié)果表明，下調(diào)血管內(nèi)皮中RhoC表達也可抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖。

綜上所述，下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中RhoC表達，對骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞的增殖和侵襲能力具有抑制作用，其機制可能與CDK、CyclinD1、MMP2、MMP9、PI3K、AKT參與有關(guān)。本研究從血管內(nèi)皮細(xì)胞角度對骨髓瘤細(xì)胞功能及可能機制進行了初步研究，下一步我們將對血管內(nèi)皮細(xì)胞參與調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的作用機制進行深入研究，為骨髓瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制提供理論依據(jù)，同時為以血管內(nèi)皮細(xì)胞中RhoC為靶點進行骨髓瘤治療奠定理論基礎(chǔ)。