彭 武，巫麗娟，魏 彬，陳 捷

四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，四川成都 610041

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是以慢性、對(duì)稱性和侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫疾病。我國RA患病率為 0.32%～0.36%，可以在任何年齡發(fā)病，女性發(fā)病率是男性的2～3 倍[1]。如果不及時(shí)治療，會(huì)導(dǎo)致軟骨退化和侵蝕、全身并發(fā)癥、身體衰弱甚至死亡[2]。盡管RA發(fā)病機(jī)制至今尚無定論，但目前主要認(rèn)為遺傳、內(nèi)分泌、環(huán)境、細(xì)胞凋亡及感染等因素可通過某些途徑影響RA的發(fā)生和發(fā)展，其中病毒感染被認(rèn)為是最重要的致病因素[3-5]。研究表明，巨細(xì)胞病毒(CMV)和EB病毒等多種病毒感染可能在 RA 發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[6]，特別是EB病毒被認(rèn)為是RA最常見的致病因素[7]。另一方面，RA患者的治療通常需要服用生物制劑(如英夫利昔單抗)、糖皮質(zhì)激素及慢作用抗風(fēng)濕藥[如甲氨蝶呤(MTX)]等中的一種或多種藥物，這些藥物在抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的同時(shí)也降低了機(jī)體的免疫功能，易引起CMV、EB病毒等繼發(fā)感染[8]。此外，CMV和EB病毒還會(huì)對(duì)RA患者治療和預(yù)后產(chǎn)生影響。在治療方面，DAVIS等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CMV持續(xù)介導(dǎo)的 T 細(xì)胞免疫變化可能會(huì)影響早期RA患者對(duì)抗風(fēng)濕藥物治療的臨床反應(yīng)。有研究報(bào)道RA患者基線外周血EB病毒DNA載量與利妥昔單抗治療效果有關(guān)，以及EB病毒感染在MTX治療RA合并相關(guān)大B細(xì)胞淋巴增生性疾病患者腫瘤發(fā)生和消退中起作用[10-11]。DAVIS等[12]研究結(jié)果表明，CMV感染的免疫反應(yīng)可能在RA患者炎癥和放射學(xué)關(guān)節(jié)損傷的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。PIERER等[13]研究發(fā)現(xiàn)，潛伏的CMV感染會(huì)加重RA的臨床病程。BROADLEY等[14]觀察到CMV感染的RA患者死于心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)增高。SATOU等[15]研究發(fā)現(xiàn)，MTX治療 RA 患者會(huì)使包括EB病毒陽性皮膚黏膜潰瘍等MTX相關(guān)淋巴組織增生性疾病的數(shù)量增加。研究者還報(bào)道了EB病毒感染的RA患者發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、口腔扁平苔蘚和EB病毒性肝炎等多種并發(fā)癥的案例[16-18]。而且，CMV本身就可導(dǎo)致被感染患者從輕微無癥狀感染到嚴(yán)重缺陷或死亡的各種結(jié)局；EB病毒則是傳染性單核細(xì)胞增多癥的病原體，與鼻咽癌、兒童淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)，EB病毒是可能致癌的人類腫瘤病毒之一。CMV和EB病毒不僅在 RA發(fā)生發(fā)展中起作用，還會(huì)影響 RA 患者的治療和預(yù)后，所以，對(duì)RA患者合并CMV和EB病毒感染的監(jiān)測及易感因素的研究具有重要價(jià)值。本研究旨在研究RA患者合并CMV和EB病毒感染的臨床實(shí)驗(yàn)室相關(guān)檢測指標(biāo)，為臨床預(yù)測RA患者合并CMV、EB病毒感染及改善這類患者的治療和預(yù)后提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2020年12月在四川大學(xué)華西醫(yī)院就診的RA患者126例作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合最新的 RA 相關(guān)指南或?qū)＜夜沧R(shí)中的確診標(biāo)準(zhǔn)[19]；(2)同時(shí)檢測了CMV-DNA和EB病毒DNA；(3)相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在其他病毒感染；(2)同時(shí)感染細(xì)菌或真菌；(3)存在嚴(yán)重基礎(chǔ)疾??；(4)合并其他風(fēng)濕免疫性疾病、艾滋病、器官移植等免疫缺陷或紊亂。本研究經(jīng)華西醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象對(duì)本研究內(nèi)容知情并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 CMV-DNA檢測使用湖南圣湘生物科技股份有限公司的人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)，EB病毒DNA檢測使用EB病毒核酸定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)，均在上海宏石全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)、SLAN?-96P 熒光定量PCR儀上檢測。

1.3方法

1.3.1臨床相關(guān)資料收集 通過醫(yī)院信息系統(tǒng)收集研究對(duì)象基本資料如性別、年齡、治療等情況，以及 RA 相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，如紅細(xì)胞沉降率、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血小板計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD3/CD4/CD8T淋巴細(xì)胞亞群和絕對(duì)計(jì)數(shù)、CD4/CD8比值、類風(fēng)濕因子、C-反應(yīng)蛋白、降鈣素原(PCT)、抗鏈球菌溶血素“O”抗體(抗鏈“O”抗體)、抗環(huán)瓜氨酸(CCP)抗體(抗CCP抗體)、免疫球蛋白、補(bǔ)體及抗核抗體。

1.3.2CMV和EB病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測 (1)檢測方法。研究對(duì)象抽取外周靜脈血至少 2 mL 于含枸櫞酸鈉抗凝劑的采血管中，立即輕輕顛倒混勻，使用圣湘全血基因組提取試劑處理，得到的 DNA 作為待測樣本。取出試劑盒中的各組分，待其溫度平衡至室溫，混勻后備用。根據(jù)待測樣本、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照及定量參考品A ～ D的數(shù)量，按每人反應(yīng)液38 μL+酶混合液 2 μL+內(nèi)標(biāo) 1.0 μL比例制成 PCR -混合液，瞬時(shí)離心后備用。陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、定量參考品A～D分別取10 μL與10 μL核酸釋放劑混勻待用。每個(gè)PCR反應(yīng)管中加入上述處理后的待測樣本、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照及定量參考品A～D各10 μL，在每管中加入PCR-混合液 40 μL，蓋上管蓋(去除氣泡后)，2 000 r/min 離心 30 s。參照PCR儀使用說明書進(jìn)行參數(shù)設(shè)置后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。(2)結(jié)果判讀。質(zhì)量控制：①陰性對(duì)照，無循環(huán)閾值(Ct)顯示，但內(nèi)標(biāo)檢測為陽性(Ct≤40)；陽性對(duì)照，檢測濃度值為(1.35×10-5～1.07×10-6)copy/mL；②4個(gè)定量參考品，均檢測為陽性且標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2≥0.98。以上要求需在同1次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行。參考區(qū)間：目標(biāo)基因的Ct陽性判斷值為39，內(nèi)標(biāo)的Ct陽性判斷值為40(若內(nèi)標(biāo)Ct>40或無顯示，則該樣本的檢測結(jié)果無效，應(yīng)查找并排除原因，并對(duì)此樣本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn))。

2 結(jié) 果

2.1基本信息 本研究共納入RA患者共126例，其中女性95例(75.40%)，男性31例(24.60%)；CMV-DNA陽性的RA患者16例，陽性率12.70%；EB病毒DNA陽性的RA患者12例，陽性率9.52%。CMV-DNA和EB病毒DNA同時(shí)陽性的RA患者6例，CMV-DNA和EB病毒DNA均陰性的RA患者104例。

2.2CMV-DNA或EB病毒DNA陽性/陰性RA患者的臨床相關(guān)指標(biāo)水平比較 CMV-DNA陽性RA患者的PCT水平[0.12(0.04,0.27)ng/mL]比CMV-DNA陰性RA患者的PCT水平[0.05(0.03,0.08)ng/mL]更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。EB病毒DNA陽性RA患者各臨床相關(guān)指標(biāo)與EB病毒DNA陰性RA患者之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表1 CMV-DNA陽性RA患者與CMV-DNA陰性RA患者臨床相關(guān)指標(biāo)比較

表2 EB病毒DNA陽性RA患者與EB病毒DNA 陰性 RA 患者臨床相關(guān)指標(biāo)比較

續(xù)表2 EB病毒DNA陽性RA患者與EB病毒DNA 陰性 RA 患者臨床相關(guān)指標(biāo)比較

2.3EB病毒DNA和CMV-DNA同時(shí)陽性/陰性的RA患者臨床相關(guān)指標(biāo)比較 EB病毒DNA和CMV-DNA同時(shí)陽性的RA患者IgA水平[4 870.00(3 040.00,5 190.00)]mg/L比二者均陰性的RA患者IgA水平[2 680.00(1 820.00,3 985.00)]mg/L更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 EB病毒DNA 和CMV-DNA 同時(shí)陽性/陰性的 RA 患者臨床相關(guān)指標(biāo)比較

續(xù)表3 EB病毒DNA 和CMV-DNA 同時(shí)陽性/陰性的 RA 患者臨床相關(guān)指標(biāo)比較

3 討 論

CMV、EB病毒影響RA患者的治療和預(yù)后，所以，對(duì)RA患者合并CMV和EB病毒感染易感因素的研究具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，CMV-DNA陽性RA患者的PCT水平比CMV-DNA陰性RA患者的PCT水平更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；EB病毒DNA和CMV-DNA同時(shí)陽性的RA患者IgA水平比二者均陰性的RA患者IgA水平更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

健康者體內(nèi)PCT水平極低，血液中幾乎檢測不到PCT(PCT<0.1 ng/mL)。當(dāng)機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重細(xì)菌、真菌、寄生蟲感染，嚴(yán)重休克、膿毒癥、全身性炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能紊亂綜合征時(shí)它在血漿中的水平會(huì)升高。細(xì)菌內(nèi)毒素在PCT的誘導(dǎo)過程中起到至關(guān)重要的作用，所以，PCT可作為一個(gè)急性炎癥指標(biāo)來鑒別細(xì)菌和非細(xì)菌性感染。自身免疫反應(yīng)、過敏和病毒感染時(shí)PCT一般不升高。但一些研究發(fā)現(xiàn)， PCT 可在特殊疾病合并病毒感染時(shí)升高，如方琪等[20]研究發(fā)現(xiàn)，哮喘合并病毒感染組血清 PCT 及 CRP 表達(dá)水平高于單純哮喘組；張正玲等[21]研究結(jié)果表明，支氣管擴(kuò)張合并EB病毒感染患者中的 PCT、CRP、IL-6水平顯著高于非EB病毒感染的支氣管擴(kuò)張患者;汪俊劍等[22]報(bào)道，結(jié)締組織病相關(guān)性間質(zhì)性肺炎患者中EB病毒DNA與PCT呈正相關(guān)。雖然目前沒有CMV感染導(dǎo)致PCT 水平升高的直接證據(jù)，但有研究提到噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增生綜合征(HLH)患者CMV感染率和PCT水平同時(shí)明顯高于非HLH的血液腫瘤患者[23]，提示CMV感染可能會(huì)影響 PCT 水平。本研究結(jié)果顯示，CMV感染的RA患者比非CMV感染的RA患者PCT水平更高。這可能是因?yàn)镃MV感染會(huì)加重RA患者炎性反應(yīng)程度，或病毒感染可促進(jìn)細(xì)菌性感染的發(fā)生或增加細(xì)菌性感染的風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果表明，PCT可作為RA患者感染CMV的預(yù)測指標(biāo)，PCT水平升高可提示臨床醫(yī)生對(duì)CMV感染患者及早進(jìn)行檢測和治療。然而CMV感染引起 RA 患者體內(nèi)PCT水平升高的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步明確。

IgA 是機(jī)體免疫細(xì)胞被細(xì)菌、真菌或病毒等抗原激活后，B細(xì)胞分化成熟為漿細(xì)胞后所合成的一類免疫球蛋白。分兩種類型即血清型IgA和分泌型IgA(SIgA)。血清型 IgA 為單體，免疫作用比較弱。SIgA是機(jī)體局部黏膜抗感染免疫的主要抗體，存在于黏膜組織如消化道、呼吸道及泌尿生殖系統(tǒng)。IgA是抑制微生物在黏膜組織附著、減緩病毒繁殖、防止病原體入侵機(jī)體的重要免疫屏障[24]。CMV可引起各系統(tǒng)感染，尤其是泌尿生殖系統(tǒng)，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生CMV-IgA。EB病毒感染可刺激機(jī)體產(chǎn)生多種IgA，如Z反式激活因子(Zta)-IgA、早期抗原(EA)-IgA、病毒衣殼抗原(VCA)-IgA和EB病毒核抗原1(EBNA1)-IgA[25-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，EB病毒DNA陽性RA患者各臨床相關(guān)指標(biāo)與EB病毒DNA陰性RA患者之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；EB病毒DNA和CMV-DNA同時(shí)陽性的RA患者IgA水平比二者均陰性的RA患者IgA水平更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而有研究也闡述了CMV合并EB病毒感染的傳染性單核細(xì)胞增多癥患者 IgA 水平比 EB 病毒單純感染的傳染性單核細(xì)胞增多癥患者更高[28]，提示CMV、EB病毒合并感染可能比EB 病毒單獨(dú)感染刺激機(jī)體產(chǎn)生IgA的作用更強(qiáng)。然而本研究病例數(shù)較少，結(jié)果需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證和謹(jǐn)慎對(duì)待。盡管如此，本研究結(jié)果還是能在一定程度上表明 IgA 可作為 RA 患者合并 CMV、EB病毒同時(shí)感染的潛在依據(jù)。

綜上所述，本研究通過回顧性分析確診RA患者合并CMV和EB病毒感染與否的相關(guān)臨床資料，發(fā)現(xiàn)PCT水平升高可提示 RA 患者 CMV感染，IgA升高可能作為 RA 患者合并CMV、EB病毒同時(shí)感染的依據(jù)。PCT 和 IgA 在 RA 患者診斷CMV 或 EB病毒 感染中具有重要價(jià)值，可作為臨床上改善 RA 患者治療效果、預(yù)后的重要檢測指標(biāo)。