白裕英，青 剛，鄧太兵，黃萬(wàn)秀，張 欣，吳 娛

廣安市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，四川廣安 638001

肺癌是世界范圍內(nèi)與癌癥相關(guān)死亡的主要原因，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占所有病例的85%[1]，且部分NSCLC患者在診斷時(shí)已不具備手術(shù)指征，因此放化療成為不可切除Ⅲ期NSCLC患者的標(biāo)準(zhǔn)方案。然而由于各種因素的影響，NSCLC患者的治療結(jié)局存在較大差異，因此尋找高效評(píng)估患者預(yù)后的生物標(biāo)志物對(duì)于指導(dǎo)臨床治療十分重要。外泌體是存在于體液中的一種膜狀微囊泡，含有大量脂類、蛋白質(zhì)、DNA和非編碼RNA(ncRNAs)等生物分子，具有細(xì)胞間信號(hào)傳遞作用[2]。尤其是一些功能性ncRNAs在癌變發(fā)生、進(jìn)展中扮演著關(guān)鍵角色。近幾年，越來(lái)越多的環(huán)形RNAs分子(circRNAs)被發(fā)現(xiàn)，并且因其特殊的結(jié)構(gòu)和重要功能而受到普遍關(guān)注[3]。最近ZHANG等[4]通過(guò)體外研究證實(shí)circRNAs特異AT序列結(jié)合蛋白2基因(circSATB2)可能通過(guò)靶向結(jié)合miR-326，進(jìn)而激活下游FSCN1信號(hào)表達(dá)，促使肺癌發(fā)展。然而，目前關(guān)于circRNAs的臨床應(yīng)用價(jià)值仍有待闡明，因此本研究旨在分析循環(huán)血清外泌體circSATB2相對(duì)表達(dá)水平對(duì)不可切除Ⅲ期NSCLC患者放化療預(yù)后的早期判斷能力。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年3月至2019年10月本院收治的150例不可切除Ⅲ期NSCLC患者(不可切除Ⅲ期NSCLC組)作為研究對(duì)象，其中男90例、女60例，年齡25～85歲，平均(51.25±13.66)歲；另選取同期在本院體檢健康的志愿者150例為健康對(duì)照組[男81例，女69例；年齡18～80歲，平均(51.70±15.14歲)]和臨床分期Ⅰ～Ⅱ期NSCLC患者149例作為早期NSCLC組[男87例，女62例；年齡22～80歲，平均(51.11±12.37)歲)]，各組年齡、性別構(gòu)成比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不可切除Ⅲ期NSCLC組完成同步放化療2周后根據(jù)其治療反應(yīng)分為緩解組和未緩解組。另外對(duì)不可切除Ⅲ期NSCLC組患者進(jìn)行至少2年隨訪，根據(jù)隨訪數(shù)據(jù)分為存活組和死亡組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)胸部腫瘤分期手冊(cè)，經(jīng)細(xì)胞學(xué)或穿刺活檢病理診斷確定為原發(fā)性NSCLC患者，并依據(jù)影像學(xué)資料按照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)第8版的原發(fā)腫瘤-區(qū)域淋巴結(jié)-遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分期(TNM分期)系統(tǒng)進(jìn)行臨床分期；(2)納入的臨床分期Ⅲ期NSCLC患者均為不能行手術(shù)切除；(3)不可切除Ⅲ期NSCLC組和早期NSCLC組患者入組前6個(gè)月未接受過(guò)手術(shù)、化療、放療及生物免疫治療；(4)年齡≥18周歲，美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)體力狀態(tài)評(píng)分≤2分，估計(jì)預(yù)期壽命至少為12周；(5)具有完整的病例資料，配合隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他類型腫瘤；(2)有并發(fā)疾病或持續(xù)/活動(dòng)性感染的證據(jù)；(3)活動(dòng)性或既往(過(guò)去2年內(nèi))有自身免疫性疾病或原發(fā)性免疫缺陷病史；(3)合并嚴(yán)重的肝腎疾病。所有研究對(duì)象都提供了書(shū)面知情同意書(shū)參與研究。研究程序及修訂獲當(dāng)?shù)赜嘘P(guān)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并按照《赫爾辛基宣言》進(jìn)行。

1.2治療 治療前評(píng)估包括詳細(xì)的臨床病史資料和一系列生化檢查。血液化學(xué)檢查合格的不可切除Ⅲ期NSCLC組和早期NSCLC組患者接受環(huán)磷酰胺為基礎(chǔ)的化療方案，包括紫杉醇、順鉑、卡鉑、長(zhǎng)春堿、足葉乙甙、培美曲塞等不同組合，并進(jìn)行同步三維適形放療(3D-CRT)。研究人員根據(jù)修訂后的實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.1版標(biāo)準(zhǔn)判斷治療反應(yīng)，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)或疾病進(jìn)展(PD)。NSCLC患者的隨訪程序包括臨床、實(shí)驗(yàn)室和成像技術(shù)，如X射線計(jì)算機(jī)斷層成像(CT)掃描或正電子發(fā)射/CT，這取決于在基線時(shí)使用哪種成像方法，不可切除Ⅲ期NSCLC組和早期NSCLC組完成同步放化療2周后進(jìn)行治療反應(yīng)判斷。CR、PR患者為緩解組，SD、PD患者為未緩解組。

1.3方法

1.3.1資料采集 收集不可切除Ⅲ期NSCLC組和早期NSCLC組患者的人口社會(huì)學(xué)資料(包括年齡、性別、病理類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)等)和治療方案(放化療方案、治療周期)。對(duì)不可切除Ⅲ期NSCLC患者進(jìn)行至少2年的隨訪，記錄總生存期(OS)。OS的定義是從開(kāi)始治療或初步診斷到死亡或最后隨訪的日期。

1.3.2循環(huán)血清外泌體circSATB2水平檢測(cè) 治療前采集3組血樣置于含乙二胺四乙酸的試管中。4 ℃下以3 000 r/min離心30 min，收集上清液，保存在-80 ℃。使用InvitrogenTM總外泌體分離試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，取500 μL血清與外泌體分離試劑混合，混合物在15 000 r/min，4 ℃下離心30 min，然后去除上清液，獲得循環(huán)血清外泌體沉淀。使用Tecnai G2 Spirit(美國(guó)FEI公司)通過(guò)透射電子顯微鏡觀察循環(huán)血清外泌體的形態(tài)和大小。利用NanoSight NS300系統(tǒng)(英國(guó)Malvern公司)進(jìn)行納米顆粒跟蹤分析，檢測(cè)分離出的循環(huán)血清外泌體大小分布。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)TSG101，CD9和CD63外泌體標(biāo)記膜蛋白。使用Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)提取循環(huán)血清外泌體總RNA，取1 μg總RNA加入20 μL混合試劑中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。然后利用circSATB2特異性引物(上游：AGCCAACCAACTCTTCCGTG，下游：AAAGCACATCTTTC CGCACC)，對(duì)循環(huán)血清外泌體circSATB2基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，用cel-miR-39用作外部參考，用2-ΔΔCt法分析循環(huán)血清外泌體circSATB2相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1循環(huán)血清外泌體獲取及鑒定 用透射電鏡觀察，顯示循環(huán)血清外泌體大小為50～150 nm，是一個(gè)膜狀結(jié)構(gòu)的微小囊泡，符合外泌體的形態(tài)特征，見(jiàn)圖1A。經(jīng)Western blot法檢測(cè)出，循環(huán)血清外泌體標(biāo)志蛋白CD9、CD63和 TSG101呈陽(yáng)性表達(dá)，確定成功分離并純化外泌體囊泡，見(jiàn)圖1B。另外經(jīng)納米顆粒追蹤技術(shù)分析，循環(huán)血清外泌體平均粒徑為(85.5±4.5)nm，見(jiàn)圖1C。

圖1 循環(huán)血清樣本中分離的外泌體特性

2.23組循環(huán)血清外泌體circSATB2相對(duì)表達(dá)水平比較 健康對(duì)照組、早期NSCLC組、不可切除Ⅲ期NSCLC組循環(huán)血清外泌體circSATB2相對(duì)表達(dá)水平分別為0.99(0.81，1.21)、1.22(0.94，1.64)和1.62(1.23，2.41)，不可切除Ⅲ期NSCLC組患者循環(huán)血清外泌體circSATB2相對(duì)表達(dá)水平高于健康對(duì)照組和早期NSCLC組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3不可切除Ⅲ期NSCLC組循環(huán)血清外泌體circSATB2相對(duì)表達(dá)水平與臨床病理特征關(guān)系 不可切除Ⅲ期NSCLC組循環(huán)血清外泌體circSATB2相對(duì)表達(dá)水平與原發(fā)腫瘤分期(T分期)、化療周期、有無(wú)放射性肺損傷有關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、區(qū)域淋巴結(jié)分期(N分期)、TNM分期、體力狀態(tài)評(píng)分(ECOG評(píng)分)、有無(wú)吸煙史、組織分化程度、病理組織類型、查爾森合并癥指數(shù)(Charlson合并癥指數(shù))、有無(wú)鞏固化療均無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 循環(huán)血清外泌體circSATB2相對(duì)表達(dá)水平與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

續(xù)表1 循環(huán)血清外泌體circSATB2相對(duì)表達(dá)水平與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4循環(huán)血清外泌體circSATB2相對(duì)表達(dá)水平與同步放化療近期療效的關(guān)系 緩解組和未緩解組循環(huán)血清外泌體circSATB2相對(duì)表達(dá)水平分別為1.42(0.96,2.36)和1.75(1.33,2.41)，未緩解組循環(huán)血清外泌體circSATB2相對(duì)表達(dá)水平高于緩解組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。將不可切除Ⅲ期NSCLC組循環(huán)血清外泌體circSATB2相對(duì)表達(dá)水平分為circSATB2<0.81，0.81≤circSATB2<0.99，0.99≤circSATB2<1.21，circSATB2≥1.21。經(jīng)單因素和多因素Logistic回歸分析，患者循環(huán)血清外泌體circSATB2≥1.21時(shí)是同步放化療近期療效的獨(dú)立影響因素(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 單因素和多因素Logistic回歸模型分析循環(huán)血清外泌體circSATB2相對(duì)表達(dá)水平與同步放化療近期療效的關(guān)系

2.5循環(huán)血清外泌體circSATB2相對(duì)表達(dá)水平與NSCLC患者隨訪2年生存預(yù)后的關(guān)系 隨訪2年，存活組和死亡組NSCLC患者循環(huán)血清外泌體circSATB2相對(duì)表達(dá)水平分別為1.33(0.89，1.55)和2.19(1.43，3.39)，死亡組循環(huán)血清外泌體circSATB2相對(duì)表達(dá)水平高于存活組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。循環(huán)血清外泌體circSATB2<0.99亞組和循環(huán)血清外泌體circSATB2≥0.99亞組各有10例(27.03%)和69例(61.06%)患者死亡。繪制Kaplan-Meier曲線，兩個(gè)亞組中位總生存時(shí)間分別為24個(gè)月和15個(gè)月，經(jīng)Log Rankχ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.236，P<0.001)。見(jiàn)圖2。

圖2 隨訪2年期間病死率Kaplan-Meier曲線

2.6ROC曲線分析circSATB2相對(duì)表達(dá)水平預(yù)測(cè)不可切除Ⅲ期NSCLC患者同步放化療近期療效和隨訪2年生存結(jié)局的臨床價(jià)值 循環(huán)血清外泌體circSATB2相對(duì)表達(dá)水平預(yù)測(cè)不可切除Ⅲ期NSCLC患者同步放化療近期療效和隨訪2年生存結(jié)局的AUC分別為0.610(95%CI：0.516～0.704)、0.778(95%CI：0.705～0.850)，對(duì)應(yīng)截?cái)嘀捣謩e為1.448、1.575，特異度分別為57.6%、70.9%，靈敏度分別為68.1%、70.4%。見(jiàn)圖3。

圖3 ROC曲線分析

3 討 論

NSCLC是最常見(jiàn)的肺癌類型[1]，對(duì)于不可切除的Ⅲ期NSCLC患者，5年生存率僅為20%[6]。近年來(lái)，circRNAs與惡性腫瘤發(fā)生機(jī)制的關(guān)系逐漸被揭示，這為新型生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供了更多可能[7]。circRNAs是一種的內(nèi)源性非編碼RNA，大量存在于循環(huán)血清外泌體中，使其具有更穩(wěn)定的存在環(huán)境[8]。circRNAs可通過(guò)穩(wěn)定的互補(bǔ)結(jié)合吸收miRNA，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。例如ZHANG等[4]證實(shí)circSATB2通過(guò)充當(dāng)miR-326海綿來(lái)上調(diào)FSCN1表達(dá)進(jìn)而加速NSCLC進(jìn)程，因此circSATB2在NSCLC組織和細(xì)胞中可能具有一定的促癌特性。

外泌體是細(xì)胞外膜狀微囊泡，其分泌的各種細(xì)胞類型直徑為40～160 nm。外泌體以選擇性的方式從具有不同表型的細(xì)胞中主動(dòng)釋放，并且必須轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞以抑制其靶mRNA，從而發(fā)揮不同的功能[9]。源自宿主細(xì)胞的外泌體可能被鄰近或遠(yuǎn)處的細(xì)胞吸收，并在這些受體細(xì)胞中發(fā)揮其生物學(xué)作用。循環(huán)血清外泌體包含大量生物學(xué)分子，如脂質(zhì)、蛋白、DNA和編碼/非編碼RNA等[10]。外泌體circRNAs是在所有真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的非編碼內(nèi)源性RNA的新家族。它具有組織特異性和細(xì)胞特異性表達(dá)模式，可共價(jià)封閉內(nèi)源性生物分子，其生物發(fā)生受特定的順式作用元件和反式作用因子調(diào)節(jié)[11-12]。與其他非編碼RNA相比，circRNAs結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，因此作為有效的生物標(biāo)志物的潛力更大[13]。

circRNAs在癌癥中的工作機(jī)制是多樣的，可作為miRNA海綿發(fā)揮作用，從而影響miRNA靶基因的表達(dá)水平[14]。ZHANG等[4]研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC細(xì)胞中circSATB2相對(duì)表達(dá)水平顯著上調(diào)，并可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。circSATB2有許多miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，表明circSATB2可能通過(guò)miRNA海綿發(fā)揮其致癌作用。miR-33a-5p是circSATB2的靶標(biāo)，并且受circSATB2負(fù)調(diào)控。據(jù)報(bào)道，miR-33a-5p作為腫瘤抑制因子與許多癌癥的進(jìn)展有關(guān)[15-16]。LIU等[10]發(fā)現(xiàn)通過(guò)上調(diào)miR-33a-5p可緩解circSATB2在雷公藤紅素治療的NSCLC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的影響，circSATB2通過(guò)下調(diào)miR-33a-5p抵消了Cela介導(dǎo)的NSCLC抑制作用，還可通過(guò)增強(qiáng)E2F7表達(dá)在Cela刺激的NSCLC細(xì)胞中起作用。circSATB2通過(guò)靶向NSCLC細(xì)胞中的miR-33a-5p表達(dá)來(lái)增強(qiáng)E2F7 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。此外CHEN等[17]發(fā)現(xiàn)，circSATB2通過(guò)結(jié)合miR-361-3p和miR-615-5p負(fù)調(diào)節(jié)其在NSCLC中的活性，而circSATB2可以直接與miR-326結(jié)合并負(fù)調(diào)控miR-326表達(dá)，從而影響NSCLC的發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，不可切除Ⅲ期NSCLC組循環(huán)血清外泌體circSATB2相對(duì)表達(dá)水平較早期NSCLC組和健康對(duì)照組升高，且其與同步放化療治療反應(yīng)和預(yù)后結(jié)局也有一定關(guān)系。同步放化療近期療效未緩解組循環(huán)血清外泌體circSATB2相對(duì)表達(dá)水平高于緩解組，隨訪2年生存預(yù)后死亡組circSATB2相對(duì)表達(dá)水平明顯高于存活組，經(jīng)ROC曲線分析顯示循環(huán)血清外泌體circSATB2相對(duì)表達(dá)水平對(duì)于預(yù)測(cè)不可切除Ⅲ期NSCLC患者同步放化療近期療效和隨訪2年生存結(jié)局都有較高的AUC，提示循環(huán)血清外泌體circSATB2相對(duì)表達(dá)水平對(duì)于預(yù)測(cè)不可切除Ⅲ期NSCLC患者的預(yù)后具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。但本研究仍處于初步探索階段，仍需要更多的基礎(chǔ)和循證醫(yī)學(xué)證據(jù)來(lái)支持該結(jié)論。