張絨 李慧芳 陳炎歡 陳仲婷

摘 要：目的：對(duì)比霉菌和酵母菌快速測(cè)試技術(shù)與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的差異性。方法：通過(guò)對(duì)食品原料進(jìn)行人工污染的方式開(kāi)展菌株適用性試驗(yàn)、方法重復(fù)性試驗(yàn)、方法顯著差異性比較試驗(yàn)，確認(rèn)快速測(cè)試技術(shù)與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法用于食品原料檢測(cè)時(shí)是否存在顯著差異。結(jié)果：兩種方法重復(fù)性限r(nóng)＜0.25，兩方法與國(guó)標(biāo)方法無(wú)顯著差異（P＞0.05）。結(jié)論：該快速測(cè)試技術(shù)適用于食品原料質(zhì)量控制的霉菌和酵母菌檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：霉菌和酵母菌；快速測(cè)試片；國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法；微生物

Comparison of Rapid Testing Technology of Mold and Yeast with National Standard Method in Food Detection

ZHANG Rong， LI Huifang， CHEN Yanhuan， CHEN Zhongting

（Infinity （China） Co.， Ltd.， Jiangmeng 529100， China）

Abstract： Objective： To compare the difference between the rapid test technology of mold and yeast and the national standard method. Method： Carry out strain suitability test， method repeatability test and method significant difference comparison test by artificially contaminating food raw materials to confirm whether there is significant difference between rapid testing technology and national standard method when used for food raw materials testing. Result： The repeatability limit of the two methods was r＜0.25， and there was no significant difference between the two methods and the national standard method （P＞0.05）. Conclusion： The rapid test technology is suitable for the detection of mold and yeast in the quality control of food raw materials.

Keywords： mold and yeast; rapid test piece; national standard method; microorganism

霉菌和酵母菌在自然界廣泛存在，受霉菌污染的食品對(duì)人體造成的危害不容小覷，輕則中毒、重則致癌、致畸、致突變。酵母菌作為一種發(fā)酵菌，可將食物中的糖發(fā)酵，易致使食品腐敗變質(zhì)，對(duì)人體造成不同程度的傷害。因此，霉菌和酵母菌檢測(cè)項(xiàng)目常被作為食品加工企業(yè)評(píng)價(jià)食品安全的重要指標(biāo)。

食品中霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)檢驗(yàn)主要依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB 4789.15—2016）[1]，但該方法的檢測(cè)周期長(zhǎng)，從樣品準(zhǔn)備到出具報(bào)告至少需要6 d，而快速測(cè)試片檢測(cè)過(guò)程僅需3 d。霉菌和酵母菌快速測(cè)試片（以下簡(jiǎn)稱(chēng)快速測(cè)試片法）是一種預(yù)先制備好的一次性培養(yǎng)基制品，含有微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及顯色劑，具有操作簡(jiǎn)便、便于運(yùn)輸、成本低等優(yōu)點(diǎn)[2]。但由于快速測(cè)試片還不是我國(guó)食品微生物檢驗(yàn)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，所以現(xiàn)階段無(wú)法在檢測(cè)機(jī)構(gòu)和食品企業(yè)中大規(guī)模應(yīng)用。

本研究將日常工作中的兩款原料進(jìn)行人工污染并作為試驗(yàn)樣品，分別添加白色念珠菌、黑曲霉兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株，采用霉菌和酵母菌快速測(cè)試片法和

GB 4789.15—2016對(duì)兩種試驗(yàn)樣品進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)開(kāi)展快速測(cè)試片法的重復(fù)性試驗(yàn)、差異比較試驗(yàn)，確認(rèn)快速測(cè)試片法是否與國(guó)標(biāo)方法存在顯著差異，為快速測(cè)試片法作為原料日常監(jiān)控霉菌和酵母菌的檢測(cè)方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

酪蛋白磷酸肽（廣州市銳力發(fā)展有限公司）；碳酸鈣（廣東大地食用化工有限公司）。

1.1.2 培養(yǎng)基及菌種

3M PetrifilmTM霉菌和酵母菌檢驗(yàn)快速測(cè)試片（3M公司）；孟加拉紅培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；白色念珠菌（ATCC 10231）、黑曲霉

（ATCC 16404），均來(lái)源于廣東省微生物菌種保藏中心（國(guó)家專(zhuān)利菌種保藏平臺(tái)）。

1.1.3 設(shè)備

超凈工作臺(tái)；生物安全柜；霉菌培養(yǎng)箱；恒溫水浴箱。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株適用性試驗(yàn)

樣品制備：按照GB 4789.15—2016方法，在25 g樣品中加入225 mL稀釋液，充分溶解，混合均勻。

試驗(yàn)菌株制備：將試驗(yàn)菌株白色念珠菌（ATCC 10231）、黑曲霉（ATCC 16404）復(fù)蘇后，制成一定濃度的菌懸液。

供試液制備：將一定濃度的試驗(yàn)菌株白色念珠菌（ATCC 10231）、黑曲霉（ATCC 16404）制成的菌懸液加入樣品中，使每1 mL樣液中含菌量為10～150 CFU。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.15—2016測(cè)試方法：按上述方法進(jìn)行樣品制備后，吸取1 mL待測(cè)樣液于平皿內(nèi)，傾注孟加拉紅瓊脂，置于（28±1）℃培養(yǎng)5 d，觀察結(jié)果。

菌株適用性試驗(yàn)方法：為確認(rèn)樣品中的微生物能被充分檢出，先選擇最低稀釋級(jí)的樣液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。加菌液的體積不超過(guò)供試液體積的1%，依照GB 4789.15—2016方法開(kāi)展檢測(cè)，培養(yǎng)后觀察結(jié)果，驗(yàn)證樣品對(duì)試驗(yàn)菌株是否有生長(zhǎng)抑制性。

1.2.2 試驗(yàn)樣品重復(fù)性試驗(yàn)

將一定濃度的試驗(yàn)菌懸液加入通過(guò)菌株適用性試驗(yàn)的樣品中，制成終濃度為10～150 CFU·mL-1的加標(biāo)樣品。

快速測(cè)試片法：按產(chǎn)品使用操作說(shuō)明，取1 mL待測(cè)樣品置于快速測(cè)試片中，置于（28±1）℃培養(yǎng)48 h后，觀察結(jié)果。

重復(fù)性分析方法：用快速測(cè)試片法對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行霉菌和酵母的檢測(cè)，每個(gè)樣品由同一操作者使用同一設(shè)備在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行兩次獨(dú)立的單次試驗(yàn)，參照《食品和動(dòng)物飼料微生物學(xué)30 ℃菌落計(jì)數(shù)方法》（SN/T 1800—2006）[3]中重復(fù)性要求進(jìn)行快速測(cè)試片法試驗(yàn)結(jié)果分析，兩次獨(dú)立的單次試驗(yàn)結(jié)果對(duì)數(shù)的絕對(duì)差值不應(yīng)大于重復(fù)性限0.25（即r≤0.25）。

1.2.3 試驗(yàn)樣品顯著性差異比較試驗(yàn)

將試驗(yàn)菌株白色念珠菌（ATCC 10231）、黑曲霉（ATCC 16404）制成高中低5種濃度的菌懸液，加入待測(cè)樣品中采用快速測(cè)試片法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)[4]。通過(guò)Minitab 15對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，若t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量的概率P＜0.05，認(rèn)為快速測(cè)試片法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法有顯著差異；P＞0.05，則認(rèn)為快速測(cè)試片法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法無(wú)顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株適用性試驗(yàn)結(jié)果

由表1、表2可知，對(duì)添加白色念珠菌（ATCC 10231）、黑曲霉（ATCC 16404）的兩種樣品按照GB 4789.15—2016開(kāi)展檢測(cè)后，結(jié)果表明霉菌和酵母菌在試驗(yàn)樣品中生長(zhǎng)良好，回收PR值在0.5～2.0，兩種樣品酪蛋白磷酸肽、碳酸鈣對(duì)所測(cè)試菌株無(wú)生長(zhǎng)抑制性。

2.2 試驗(yàn)樣品重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

由表3、表4可知，用快速測(cè)試片法進(jìn)行霉菌和酵母菌測(cè)試，參照《食品和動(dòng)物飼料微生物學(xué)30 ℃菌落計(jì)數(shù)方法》（SN/T 1800—2006）中重復(fù)性要求進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明，酪蛋白磷酸肽和碳酸鈣樣品采用快速測(cè)試片法的兩次測(cè)試結(jié)果r值均＜0.25，重復(fù)性結(jié)果可接受。

2.3 試驗(yàn)樣品顯著性差異比較試驗(yàn)結(jié)果

由表5、表6可知，用快速測(cè)試片和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法分別對(duì)添加菌液的樣品進(jìn)行霉菌和酵母計(jì)數(shù)檢測(cè)，t檢驗(yàn)分析后表明，酪蛋白磷酸肽中，霉菌t=1.55，P=0.132（P＞0.05），酵母菌t=0.03，P=0.974（P＞0.05）；碳酸鈣中，霉菌t=0.14，P=0.888（P＞0.05），酵母菌t=-0.01，P=0.989（P＞0.05）。結(jié)果表明，酪蛋白磷酸肽和碳酸鈣兩組樣品采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法和快速法測(cè)試的霉菌和酵母菌檢測(cè)結(jié)果均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

3 結(jié)論與探討

通過(guò)Minitab 15對(duì)霉菌和酵母菌快速測(cè)試片法與《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB 4789.15—2016）方法的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示快速測(cè)試片法與國(guó)標(biāo)方法相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。霉菌和酵母菌快速測(cè)試片易于操作，無(wú)需其他輔助器具即可快速檢測(cè)樣品，能有效縮短檢測(cè)周期，達(dá)到快速評(píng)估的目的，同時(shí)該方法也得到美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）的認(rèn)可。

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果參照《食品和動(dòng)物飼料微生物學(xué)30 ℃菌落計(jì)數(shù)方法》（SN/T 1800—2006）中重復(fù)性要求對(duì)快速測(cè)試片法檢測(cè)霉菌和酵母的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果在要求范圍。但由于重復(fù)性限的范圍（r≤0.25）較寬，對(duì)數(shù)據(jù)的要求不嚴(yán)格，在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，建議根據(jù)情況采取等效的、更嚴(yán)格的控制方法和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行仲裁判定，確保風(fēng)險(xiǎn)得到有效控制[5]。

本試驗(yàn)所用酵母和霉菌測(cè)試片，其培養(yǎng)基含有作為載體的冷水可溶性凝膠和對(duì)霉菌和酵母敏感的指示劑（5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽），與酵母、霉菌在培養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)生特異性顯色反應(yīng)，通過(guò)生長(zhǎng)特征和顏色變化來(lái)判定霉菌和酵母的種類(lèi)和數(shù)量[6]。其中酵母菌為藍(lán)綠色，較小菌落，筆者在其他物料的檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其中的小型顆粒比較容易在檢測(cè)過(guò)程中被染色，對(duì)結(jié)果判讀造成干擾，建議對(duì)于需要用快速測(cè)試片法進(jìn)行檢測(cè)的機(jī)構(gòu)或企業(yè)，在使用前應(yīng)針對(duì)每一種物料進(jìn)行適用性驗(yàn)證，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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