李茂林，陳喆，2*，周紅燕，吳佳玲，李侃麒，游少鴻，2

（1.桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣西 桂林 541004；2.桂林理工大學(xué)，廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541004）

鎘（Cd）作為一種主要的無(wú)機(jī)污染物，在土壤中通常具有較高的生物利用性，容易從土壤轉(zhuǎn)移到食物鏈，并通過(guò)食物鏈的生物蓄積效應(yīng)對(duì)人類健康構(gòu)成威脅，近年來(lái)備受關(guān)注。2014 年《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，我國(guó)耕地土壤重金屬的總超標(biāo)率為19.4%，其中Cd 的點(diǎn)位超標(biāo)率高達(dá)7.0%。因此，如何快速、有效地削減耕地土壤中Cd的含量，對(duì)保障我國(guó)糧食安全、人體健康與高質(zhì)量發(fā)展需求具有重大現(xiàn)實(shí)意義。

目前，針對(duì)重金屬污染土壤的修復(fù)，已經(jīng)開發(fā)了多種原位和異位修復(fù)技術(shù)，例如固化、穩(wěn)定化、土壤淋洗、植物修復(fù)。化學(xué)和物理修復(fù)方法用于去除土壤Cd 的成本較高，且會(huì)破壞耕地土壤服務(wù)功能，與此相比，植物修復(fù)技術(shù)作為一種重金屬污染修復(fù)技術(shù)，具有原位修復(fù)、成本低、環(huán)境友好、無(wú)二次污染、景觀美化等諸多優(yōu)點(diǎn)。其中的植物提取技術(shù)是通過(guò)連續(xù)種植富集植物將重金屬等污染物吸收富集至地上部從而實(shí)現(xiàn)提取凈化土壤中污染物的目標(biāo)，這種方法不會(huì)破壞土壤原始結(jié)構(gòu)和微生物活性。然而，植物提取效率受到植物對(duì)重金屬的吸收富集量、植物生物量、土壤pH、養(yǎng)分、修復(fù)時(shí)間等因素的限制。目前，大多研究人員更專注于通過(guò)提高重金屬生物富集率和增加植物生物量來(lái)提高富集植物對(duì)重金屬的提取效率。研究表明，某些材料可用于提高植物產(chǎn)量或活化土壤金屬有效性，從而增加植物對(duì)金屬的吸收富集量，進(jìn)而縮短修復(fù)所需的時(shí)間。低分子量有機(jī)酸主要源自耕層土壤有機(jī)質(zhì)分解、植物根系分泌物和微生物代謝物，其通過(guò)對(duì)金屬螯合/絡(luò)合特性以及對(duì)微生物活性和根際物理特性的間接影響來(lái)調(diào)控離子溶解度和吸收速率。檸檬酸和蘋果酸不僅是根系分泌物中常見的天然低分子量有機(jī)酸，還是高效的活化劑，其可有效提高土壤中植物可利用態(tài)Cd 的含量，進(jìn)而強(qiáng)化植物對(duì)Cd 的吸收富集。水培研究表明，添加100μmol·L的檸檬酸和蘋果酸顯著促進(jìn)了秋華柳對(duì)Cd 的吸收和積累。土培盆栽研究表明，基施濃度為5 mmol·kg的檸檬酸時(shí)，青葙對(duì)Cd 的吸收富集效率最佳，相對(duì)于植物旺盛時(shí)加入強(qiáng)化劑，基施對(duì)植物的抗逆性要求更高，但可有效縮短修復(fù)所需時(shí)間?，F(xiàn)已知的超積累植物有721種，但Cd的超富集植物僅有7種，其中伴礦景天（）是工程應(yīng)用最為廣泛的一種Cd 超富集植物。目前，對(duì)于伴礦景天修復(fù)污染土壤的研究主要集中于伴礦景天與其他植物間作、套作、輪作，添加化學(xué)改良劑、調(diào)整種植密度、調(diào)控肥料和強(qiáng)化微生物等方面。草酸和乙二胺二琥珀酸等有機(jī)酸已經(jīng)用于伴礦景天修復(fù)Cd 污染土壤，但施加檸檬酸和蘋果酸是否能強(qiáng)化伴礦景天對(duì)Cd 的吸收富集還不清楚。種子育苗、扦插育苗和組培育苗是伴礦景天3 種不同的育苗方式，伴礦景天的種子小、不易收集且發(fā)芽率低，難以大規(guī)模應(yīng)用，而無(wú)性繁殖的組培苗和扦插苗既可保留其生物特性，又可以大量擴(kuò)繁，因此有較高的研究和應(yīng)用價(jià)值。目前，組培嫩苗和扦插老苗對(duì)Cd污染土壤的適應(yīng)性及修復(fù)效率是否存在明顯差異尚不清楚。

因此，本研究利用土培盆栽試驗(yàn)的方法，選用檸檬酸和蘋果酸作為輔助強(qiáng)化劑，研究?jī)煞N強(qiáng)化劑對(duì)伴礦景天修復(fù)Cd污染土壤的效果與機(jī)制。同時(shí)選用伴礦景天組培苗和扦插苗，研究?jī)煞N苗富集Cd的差異性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植物：伴礦景天組織培養(yǎng)苗（ZP），由中國(guó)科學(xué)院植物研究所提供，無(wú)污染基質(zhì)室內(nèi)培養(yǎng)而成。伴礦景天扦插苗（QC），2017 年3 月在云南省蘭坪大田示范基地種植組培苗生長(zhǎng)至壯苗，2018年1月將壯苗分株扦插移栽于廣東省仁化大田示范基地，2018 年6月收割地上部（留茬5 cm），留茬生長(zhǎng)至2019年1月后分株為扦插苗用于本研究。兩種伴礦景天苗均先在裝有無(wú)污染基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)土的穴盤中預(yù)培養(yǎng)45 d，然后再進(jìn)行移栽。

供試土壤：土壤采自廣西壯族自治區(qū)桂林市陽(yáng)朔縣興坪鎮(zhèn)思的村某鉛鋅礦周邊污染農(nóng)田（24°59'6.4″N、110°33'25.3″ E）0~20 cm 表層土壤。將采集的土壤置于陰涼處自然風(fēng)干，剔除石子和枯葉等雜物，壓碎后過(guò)10 目篩，并取混合樣品過(guò)20 目和100 目尼龍篩，裝袋備用。供試土壤的基本理化性質(zhì)見表1。根據(jù)《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)（試行）》（GB 15618—2018），土壤 pH 為 5.18，土壤總Cd含量為2.29 mg·kg，超過(guò)農(nóng)用地土壤風(fēng)險(xiǎn)管制值（Cd≤1.5 mg·kg），確定該供試土壤為偏酸性重度Cd污染土壤。

表1 供試土壤的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of test soil

供試有機(jī)酸：檸檬酸（Citric acid）和蘋果酸（Malic acid）均為阿拉丁公司生產(chǎn)的分析純化學(xué)試劑。

1.2 盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于 2019 年 2 月 20 日至 7 月 6 日在桂林理工大學(xué)重金屬污染植物修復(fù)試驗(yàn)基地進(jìn)行。稱取6.5 kg 過(guò)10 目篩的風(fēng)干土壤填裝于18 個(gè)塑料盆（上口直徑25 cm、底部直徑19.5 cm、高20 cm）中。移苗前將5 mmol·kg（以風(fēng)干土壤質(zhì)量計(jì)）檸檬酸和蘋果酸以溶液形式加入盆栽土壤中，翻動(dòng)并平衡2 周后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的伴礦景天苗（組培苗高5~7 cm，扦插苗高10~13 cm），移栽于盆中，每盆4株。另設(shè)不加強(qiáng)化劑的空白對(duì)照處理。本試驗(yàn)共設(shè)計(jì)6 個(gè)處理：（1）ZP-CK，種植組培苗但不加強(qiáng)化劑；（2）ZP-CA，基施檸檬酸種植組培苗；（3）ZP-MA，基施蘋果酸種植組培苗；（4）QC-CK，種植扦插苗但不加強(qiáng)化劑；（5）QCCA，基施檸檬酸種植扦插苗；（6）QC-MA，基施蘋果酸種植扦插苗。每個(gè)處理重復(fù)3 次，隨機(jī)排列且定期變換位置。景天苗生長(zhǎng)期間，定期澆水，使土壤含水量保持在田間最大持水量的60%~70%。

1.3 樣品的采集、處理及測(cè)定

按照水土比2.5∶1 的方法測(cè)定土壤pH，參照《土壤 pH 值的測(cè)定 電位法》（HJ 962—2018）；有機(jī)質(zhì)含量采用水合熱重鉻酸鉀氧化-比色法測(cè)定；土壤銨態(tài)氮、有效磷、速效鉀含量采用聯(lián)合浸提-比色法測(cè)定，參照《酸性土壤銨態(tài)氮、有效磷、速效鉀的測(cè)定聯(lián)合浸提-比色法》（NY/T 1849—2010）。土壤重金屬總量測(cè)定，采用美國(guó)環(huán)保署推薦的HNO-HO消解法處理（USEPA：Method 3050B），分析過(guò)程中加入土壤標(biāo)準(zhǔn)樣品（GSS-23）和空白進(jìn)行質(zhì)量控制，樣品回收率均在90%~110%之間，消解所用試劑均為優(yōu)級(jí)純，所用水均為超純水，土壤有效態(tài)Cd 含量采用DTPA 法浸提，參照《土壤質(zhì)量有效態(tài)鉛和鎘的測(cè)定原子吸收法》（GB/T 23739—2009），并用 ICP-MS（PE NexION 350）測(cè)定土壤Cd的含量。

非損傷微測(cè)試技術(shù)（NMT）可以非侵入性地獲取有關(guān)材料表面特定離子/分子活性的動(dòng)態(tài)信息。使用NMT 系統(tǒng)（NMT150-SIM-XY，Younger USA LLC）研究土培伴礦景天根系微區(qū)（分生區(qū)、伸長(zhǎng)區(qū)、成熟區(qū)）Cd的吸收/外排情況。測(cè)定Cd通量的玻璃微電極制作：向組織樣品專用流速傳感器（XY-CGQ-01）內(nèi)注入 1 cm 左右長(zhǎng)度的灌沖液[10 mmol·LCd（NO）、0.1 mmol·LKCl]，然后向傳感器尖端填充40~50μm的Cd液體交換劑（XY-SJ-Cd-10），接著用細(xì)砂紙摩擦玻璃微流速傳感器固定架（XY003-Y11）上的銀絲，以去除表面氧化層，在0.1 mol·LKCl 溶液中氯化20~30 s后，插入微電極傳感器的背面，以與電解質(zhì)溶液進(jìn)行電接觸。在Cd通量測(cè)定中，使用含有0.05、0.1、0.5 mmol·LCdSO以及0.1 mmol·LKCl和0.3 mmol·LMES，pH 5.8 的標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)微電極。當(dāng)通過(guò)3 個(gè)點(diǎn)繪制的能斯特斜率為25~32 mV·de?cade時(shí)，則校準(zhǔn)工作完成。然后將生長(zhǎng)了4 個(gè)月的伴礦景天整顆帶土挖出，帶土根部放入裝水的500 mL 塑料燒杯中浸泡12 h 后，先用自來(lái)水沖洗根部附著的泥土，再用去離子沖洗干凈，沿根尖切下3~5 cm長(zhǎng)的根，轉(zhuǎn)移到裝有0.1 mmol·LCdSO的測(cè)試溶液中（pH 5.8），平衡 10 min 后，以 30 μm 步距對(duì)根部微區(qū)進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)顯微鏡觀察根部微區(qū)的形態(tài)特點(diǎn)來(lái)區(qū)分不同微區(qū)的長(zhǎng)度，在距根尖約100、500、1 500μm 附近的根表面測(cè)定Cd通量，分別代表根部分生區(qū)（Meristem zone）、伸長(zhǎng)區(qū)（Elongation zone）和成熟區(qū)（Mature zone），測(cè)定值穩(wěn)定后，記錄10 min 的數(shù)據(jù)，且每個(gè)部位重復(fù)測(cè)定3次。

植物收獲后分解為根、莖、葉3 部分。根部先用自來(lái)水洗凈后，再用10 mmol·LNa-EDTA 浸泡15 min 以去除吸附在根表面的重金屬，最后用去離子水沖洗3 次；莖、葉部分先用自來(lái)水沖洗3 次，再用去離子水沖洗3 次。將洗凈的根、莖、葉于105 ℃下殺青30 min，70 ℃下烘干至質(zhì)量恒定，用電子天平稱量并記錄各部分干質(zhì)量，之后放入粉碎機(jī)中粉碎，裝袋待測(cè)。植物樣品消煮方法與土壤相同，采用植物樣品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GSV-2）和空白進(jìn)行質(zhì)量控制，樣品回收率均在90%~110%之間。采用ICP-OES（PE Optima 7000 DV）測(cè)定樣品Cd 含量。植物收獲時(shí)，采集植物根部區(qū)域的土壤，將其置于陰涼處自然風(fēng)干后，過(guò)20 目和100目尼龍篩，裝袋備用。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019和Origin 2017處理和做圖，用SPSS 25單因素方差分析（ANOVA）和Duncan 法對(duì)多組樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和顯著性檢驗(yàn)（<0.05）。植物富集系數(shù)（BCF）和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（TF）的計(jì)算公式為：

富集系數(shù)=植株Cd 含量（mg·kg）/土壤Cd 含量（mg·kg）

轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)=植株地上部Cd含量（mg·kg）/植株地下部Cd含量（mg·kg）

根、莖、葉間轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)計(jì)算公式：

根-莖的 Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（TF）=植株莖部 Cd 含量（mg·kg）/植株根部Cd含量（mg·kg）

莖-葉的 Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（TF）=植株葉部 Cd 含量（mg·kg）/植株莖部Cd含量（mg·kg）

2 結(jié)果與分析

2.1 基施檸檬酸和蘋果酸對(duì)伴礦景天生物量的影響

由表2 可知，兩種伴礦景天苗各組織生物量均表現(xiàn)為葉>莖>根，不同處理下伴礦景天生物量表現(xiàn)為檸檬酸>蘋果酸>空白對(duì)照，伴礦景天扦插苗生物量高于組培苗。施加檸檬酸和蘋果酸處理下，伴礦景天生物量較對(duì)照組分別增加了32.7%~34.7%和23.4%~24.2%，QC-CA 處理的根、莖、葉生物量最高，分別為2.07、4.05、9.55 g·盆，較QC-CK 顯著增加了25.5%、30.6%、38.8%。

表2 不同處理方式下伴礦景天各組織生物量（g·盆-1）Table 2 Biomass of of Sedum plumbizincicola under different treatments（g·pot-1）

2.2 基施檸檬酸和蘋果酸對(duì)土壤有效態(tài)Cd 及pH 的影響

由圖1 可知，與供試土壤相比，添加5 mmol·kg檸檬酸和蘋果酸后，土壤中有效態(tài)Cd 含量顯著增加了19.9%~25.8%和14.3%~19.2%。ZP-CA 處理有效態(tài) Cd 含量最高，為 1.42 mg·kg，QC-CK 處理有效態(tài)Cd含量最低，為1.12 mg·kg。

圖1 不同處理對(duì)土壤有效態(tài)Cd及pH的影響Figure 1 Effects of different treatments on soil available Cd and pH

與供試土壤相比，施加5 mmol·kg檸檬酸和蘋果酸后，土壤pH顯著降低了0.20~0.25個(gè)和0.13~0.17個(gè)單位，ZP-CK 處理土壤 pH 最高，為 5.15，QC-CA 處理土壤pH最低，為4.92。

2.3 基施檸檬酸和蘋果酸對(duì)伴礦景天Cd含量的影響

由圖2可知，不同處理下的伴礦景天各組織中Cd含量分布規(guī)律為葉>莖>根。不同處理伴礦景天根、莖、葉中Cd含量規(guī)律均為檸檬酸>蘋果酸>空白對(duì)照，QC-CA 處理的根、莖、葉組織中Cd 含量最高，分別為227.5、398.1、645.5 mg·kg。與對(duì)照組相比，施加檸檬酸處理的根、莖、葉Cd 含量分別顯著增加55.3%、19.3%、42.6%，施加蘋果酸處理的根、莖、葉Cd含量分別增加44.2%、9.9%、24.3%。與Cd 超富集植物標(biāo)準(zhǔn)（植物葉組織的干質(zhì)量中Cd 含量>100 μg·g）相比，本研究中伴礦景天葉組織Cd 含量是該標(biāo)準(zhǔn)的3.36~6.46倍，遠(yuǎn)超標(biāo)準(zhǔn)值。

圖2 不同處理方式下伴礦景天各組織中的Cd含量Figure 2 Contents of Cd in Sedum plumbizincicola tissues under different treatments

2.4 基施檸檬酸和蘋果酸對(duì)伴礦景天富集與轉(zhuǎn)運(yùn)Cd能力的影響

由表3可知，伴礦景天地上部對(duì)Cd的富集量遠(yuǎn)高于地下部，是地下部的15.0~18.3倍，對(duì)土壤Cd的富集量有94.1%位于地上部。有機(jī)酸處理下兩種伴礦景天苗生物量規(guī)律為檸檬酸>蘋果酸>空白對(duì)照，其中QCCA處理對(duì)土壤Cd的富集量最高，為8.24 mg·盆，ZPCK 處理最低，為1.88 mg·盆。施加檸檬酸和蘋果酸處理的伴礦景天與對(duì)照組相比，地上部Cd富集量分別增加了73.8%~90.4%和34.5%~61.6%。

表3 不同處理伴礦景天對(duì)Cd的富集與轉(zhuǎn)運(yùn)特征Table 3 Characteristics of Cd enrichment and translocation in Sedum plumbizincicola with different treatments

兩種伴礦景天苗對(duì)土壤Cd均具有很高的富集系數(shù)（129.2~229.8），施加檸檬酸和蘋果酸顯著提高了伴礦景天對(duì)Cd的富集能力，富集規(guī)律為檸檬酸>蘋果酸>空白對(duì)照，其中QC-CA處理的富集系數(shù)最大。

伴礦景天地上部對(duì)地下部的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)為2.20~3.03，施加檸檬酸和蘋果酸后，地上部對(duì)地下部Cd轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)分別顯著降低了6.1%~17.2%和10.6%~22.4%，莖對(duì)根部的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)為1.64~2.35，Cd轉(zhuǎn)運(yùn)能力較高，葉對(duì)莖部的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)為1.17~1.62。

2.5 基施檸檬酸和蘋果酸對(duì)伴礦景天根部微區(qū)Cd 吸收/外排的影響

由圖3 和圖4 可知，各處理組伴礦景天根部微區(qū)Cd流速均為負(fù)值，即表示吸收Cd。根部不同區(qū)域Cd流速差異較大，流速大小依次為伸長(zhǎng)區(qū)>分生區(qū)>成熟區(qū)，其中QC-CA 處理伸長(zhǎng)區(qū)Cd平均流速最大，為-39.95 pmol·cm·s，ZP-CK 處理成熟區(qū) Cd平均流速最小，僅為-5.53 pmol·cm·s。伴礦景天扦插苗根部各微區(qū)Cd流速高于同處理的組培苗，與對(duì)照組相比，施加檸檬酸和蘋果酸增加了伴礦景天根部微區(qū)Cd流速，且施加檸檬酸后根部微區(qū)Cd流速增加量高于施加蘋果酸。

圖3 不同處理伴礦景天根部微區(qū)凈Cd2+流速Figure 3 Net Cd2+in the root micro zone of Sedum plumbizincicola of different treatments

續(xù)圖3 不同處理伴礦景天根部微區(qū)凈Cd2+流速Continued figure 3 Net Cd2+flux in the root micro zone of Sedum plumbizincicola of different treatments

圖4 不同處理伴礦景天根部微區(qū)平均Cd2+流速Figure 4 The average Cd2+flux in the root micro zone of Sedum plumbizincicola of different treatments

3 討論

3.1 基施檸檬酸和蘋果酸對(duì)土壤pH 和Cd 有效性的影響

檸檬酸和蘋果酸都屬于低分子量有機(jī)酸，其官能團(tuán)（如羧基）是金屬的重要結(jié)合位點(diǎn)，含有2 個(gè)或3 個(gè)羧基的蘋果酸和檸檬酸，可以與Cd 形成具有五元環(huán)或六元環(huán)結(jié)構(gòu)的Cd-有機(jī)酸螯合物，從而解吸更多的土壤Cd。土壤薄層色譜和土柱試驗(yàn)也表明，檸檬酸和蘋果酸增強(qiáng)了Cd 的遷移。在本研究中，施加檸檬酸和蘋果酸后，土壤有效態(tài)Cd 含量與對(duì)照組相比顯著增加，說(shuō)明施加的有機(jī)酸可活化土壤中的Cd，提高土壤中Cd的生物利用度。檸檬酸處理組土壤有效態(tài)Cd 含量高于蘋果酸處理，這可能得益于檸檬酸較大的分子量和較高的Cd-檸檬酸螯合系數(shù)。前人研究表明，與分子量較小的蘋果酸相比，檸檬酸帶有更多的負(fù)電荷，具有更大的表面積和更強(qiáng)的吸附、螯合重金屬的能力，檸檬酸與Cd 的螯合常數(shù)又高于蘋果酸，因此檸檬酸螯合Cd 的能力大于蘋果酸。研究表明，檸檬酸對(duì)Cd遷移率的影響高于蘋果酸，施加檸檬酸和蘋果酸后，土壤乙酸可提取Cd 的比例分別增加6.11%~9.43%和3.06%~6.63%，而乙酸可萃取Cd又與重金屬的可萃取性呈正相關(guān)關(guān)系，表明檸檬酸在提高土壤Cd 有效性方面要優(yōu)于蘋果酸，這與本研究結(jié)果一致。

研究表明，施加的檸檬酸和蘋果酸不僅可以與金屬離子形成可溶性螯合物，改變重金屬的溶解度，還可以酸化土壤。本研究中，施加檸檬酸和蘋果酸后，土壤pH 低于對(duì)照組0.13~0.25 個(gè)單位，一方面，得益于施加檸檬酸和蘋果酸電離出的H，另一方面，得益于伴礦景天根部分泌的有機(jī)酸、離子交換作用和呼吸產(chǎn)生的CO溶解作用。SUN等的研究也表明伴礦景天和東南景天的根系土壤會(huì)被酸化。在本研究中，施加檸檬酸的土壤pH 比施加蘋果酸低0.07~0.08 個(gè)單位，可能是因?yàn)闄幟仕岜忍O果酸多電離一個(gè)H，和/或施加檸檬酸的伴礦景天根部分泌更多的H和有機(jī)酸，也可能是土壤自身的緩沖作用。隨著土壤pH 的降低，重金屬Cd 的有效性會(huì)增加，這也是施加檸檬酸和蘋果酸后，土壤有效態(tài)Cd 含量顯著增加的原因之一。

3.2 基施檸檬酸和蘋果酸對(duì)伴礦景天生物量與Cd 含量的影響

研究發(fā)現(xiàn)，添加5 mmol·kg的草酸、檸檬酸和蘋果酸顯著增加了Cd、Pb 污染土壤中籽粒莧的生物量。在本研究中，與對(duì)照組相比，施加檸檬酸和蘋果酸后，伴礦景天的生物量顯著提高，且檸檬酸處理的伴礦景天生物量高于蘋果酸處理，這可能得益于施加有機(jī)酸對(duì)土壤的改善作用。研究表明，施加檸檬酸后，土壤有效磷和堿解氮含量、細(xì)菌數(shù)量，土壤酶（酸性磷酸酶和脲酶）活性和細(xì)菌群落Cd 抗性均高于施加同濃度蘋果酸，這表明檸檬酸在活化土壤養(yǎng)分、增加細(xì)菌數(shù)量、提高酶活性和改善細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)方面的表現(xiàn)優(yōu)于蘋果酸，改善后的土壤有利于植物生長(zhǎng)，增加植物生物量。微生物生物量和酶活性是衡量土壤微生態(tài)的重要生化指標(biāo)，施加檸檬酸和蘋果酸對(duì)改善土壤微生態(tài)也具有積極作用。TAO 等研究發(fā)現(xiàn)，25 μmol·LCdCl脅迫3 d 后，東南景天根系分泌物中的有機(jī)酸（草酸、酒石酸、蘋果酸和檸檬酸）增加，根系分泌的有機(jī)酸可以用于緩解Cd的毒性。有機(jī)酸可通過(guò)與根系分泌物的絡(luò)合作用和與微生物生物量的協(xié)同作用來(lái)降低金屬離子對(duì)植物的毒性。有研究表明，游離Cd對(duì)作物的毒性比Cd-有機(jī)酸螯合態(tài)更大，與蘋果酸和草酸相比，檸檬酸在減輕Cd 的毒性作用方面效果更好。因此，有機(jī)酸與Cd 形成的金屬螯合物減輕了Cd 對(duì)植物的毒性，緩解了Cd 對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用，而與蘋果酸處理相比，檸檬酸能更好地緩解Cd 的毒性，這間接解釋了檸檬酸處理組伴礦景天生物量高于蘋果酸處理的原因（表2）。

已有研究表明，施加酒石酸、蘋果酸、草酸、檸檬酸顯著增加了籽粒莧、龍葵、商陸、青葙和八寶景天根部與地上部的Cd 含量并提高了Cd 的富集系數(shù)，施加茶皂素和檸檬酸處理增加了伴礦景天根部和地上部Cd 含量，與蘋果酸和草酸相比，檸檬酸在增強(qiáng)商陸對(duì)Cd 的吸收方面效果更好。在本研究中，施加檸檬酸和蘋果酸后的兩種伴礦景天苗的根、莖、葉部Cd 含量與對(duì)照組相比均有所增加，施加檸檬酸的伴礦景天各組織Cd 含量高于施加蘋果酸，這說(shuō)明檸檬酸對(duì)提高伴礦景天吸收Cd的效果好于蘋果酸。早期的研究表明，當(dāng)植物暴露于重金屬脅迫時(shí)，植物細(xì)胞中可能會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸作為重金屬螯合的潛在配體，因此有機(jī)配體在植物的重金屬耐受和解毒中發(fā)揮重要作用。TAO 等研究發(fā)現(xiàn)，超積累型東南景天木質(zhì)部汁液中的主要Cd 存在形態(tài)是游離Cd（43.9%~44.5%），其次是Cd-蘋果酸（22.9%~24.7%）和Cd-檸檬酸（17.6%~18.9%），該結(jié)果表明 Cd 主要以Cd、Cd-蘋果酸或Cd-檸檬酸螯合物形式從根部轉(zhuǎn)移到地上部。施加同水平的檸檬酸和蘋果酸時(shí)，土壤中的Cd-檸檬酸螯合物含量高于Cd-蘋果酸螯合物，這些螯合物可能直接被根部吸收利用，也可能在Cd-有機(jī)酸螯合物與根區(qū)結(jié)合時(shí)，解離并釋放Cd，從而再被根部吸收，而Cd-有機(jī)酸螯合物含量越高，伴礦景天可吸收利用的Cd 越多，相應(yīng)的伴礦景天植株Cd 含量越高。

LU 等發(fā)現(xiàn)添加檸檬酸可提高東南景天中Cd從根到地上部的遷移率。在本研究中，施加檸檬酸和蘋果酸顯著提高了伴礦景天對(duì)Cd 的富集系數(shù)，這表明檸檬酸和蘋果酸可增強(qiáng)伴礦景天的土壤Cd的富集能力，檸檬酸處理的Cd富集系數(shù)高于蘋果酸，這表明檸檬酸提高伴礦景天富集Cd的能力高于蘋果酸。

3.3 基施檸檬酸和蘋果酸對(duì)伴礦景天根系微區(qū)Cd2+流速的影響

研究發(fā)現(xiàn)，東南景天根尖0~10 mm 段中的Cd 濃度顯著高于10~20 mm 段，伴礦景天和東南景天根尖區(qū)域通常有很高的Cd吸收量，離根尖越遠(yuǎn)，凈Cd吸收量減少越多。在本研究中，不同處理伴礦景天根部Cd流速表現(xiàn)為伸長(zhǎng)區(qū)>分生區(qū)>成熟區(qū)，且位于根尖伸長(zhǎng)區(qū)的Cd流速遠(yuǎn)大于遠(yuǎn)離根尖的成熟區(qū)，這與前人的研究結(jié)果一致。在本研究中，與對(duì)照組相比，施加檸檬酸和蘋果酸均增加了伴礦景天根部各區(qū)域Cd流速，且檸檬酸處理的伴礦景天根部各區(qū)域Cd流速高于蘋果酸處理，這表明施加檸檬酸和蘋果酸均能增加伴礦景天根部對(duì)土壤Cd 的吸收速率，且檸檬酸的增加效果好于蘋果酸。

目前，對(duì)于Cd 在根表面進(jìn)行跨細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)姆绞街饕袃煞N看法：一個(gè)是，包含Cd超富集物種在內(nèi)的植物可以通過(guò)離子通道或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白吸收Cd；另一個(gè)是，超富集植物對(duì)Cd 吸收可以通過(guò)高親和力傳輸系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)（如特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白），雖然到目前為止，在植物的根細(xì)胞膜中還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)高親和力的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，但生理學(xué)證據(jù)表明在超富集植物的根中存在特定的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。已有研究表明，根毛細(xì)胞質(zhì)膜中豐富的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和通道促進(jìn)了Cd的吸收，在擬南芥、在煙草和東南景天中過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)了植物對(duì)Cd的耐受性和積累能力。施加的檸檬酸和蘋果酸與土壤中Cd 發(fā)生螯合反應(yīng)，產(chǎn)生的Cd-有機(jī)酸螯合物和解離的Cd可能會(huì)刺激伴礦景天根細(xì)胞中Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過(guò)表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)了對(duì)Cd 的耐受性和積累能力，促使伴礦景天吸收更多的Cd。此外，還存在許多其他的Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)通道，例如Cd 和Zn 具有相同的價(jià)態(tài)和相似的離子半徑，Cd 可以借助Zn 的轉(zhuǎn)運(yùn)通道進(jìn)入植物體內(nèi)。根尖分生區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)主要進(jìn)行細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)，其有大量的ATP、較高的呼吸速率和基因表達(dá)水平，較高的細(xì)胞活性和某些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)可能促進(jìn)了Cd 的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收，而成熟區(qū)已經(jīng)完成細(xì)胞分化，主要進(jìn)行礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素吸收，細(xì)胞膜中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和通道對(duì)Cd也有一定的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收能力。

3.4 伴礦景天組培苗和扦插苗修復(fù)Cd污染土壤的差異

在本研究中，同處理的伴礦景天扦插苗根、莖、葉Cd 含量、各組織的生物量、根部微區(qū)的Cd流速和富集與轉(zhuǎn)運(yùn)Cd 的能力均高于組培苗，這可能與所選苗的特性有關(guān)。研究采用的伴礦景天扦插苗為直徑在5 mm 左右、長(zhǎng)度8~10 cm、帶全量葉的營(yíng)養(yǎng)枝條，經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)成為壯苗，具有生根快、生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)，原生長(zhǎng)區(qū)域歷經(jīng)云南和廣東Cd 污染土壤的馴化，且原生土壤環(huán)境（pH 5.87，總Cd含量4.22 mg·kg）與本試驗(yàn)移栽土壤有很高相似度，已形成高Cd 耐受性和低pH抗性，因此移栽后能快速適應(yīng)。組培苗直徑在3 mm左右、長(zhǎng)度4~5 cm、帶全量葉，在無(wú)Cd 的培養(yǎng)基和無(wú)污染基質(zhì)（pH 為7.0 左右）中培養(yǎng)，沒(méi)有形成Cd 耐受性和低pH抗性，移栽后需要逐漸適應(yīng)新環(huán)境，因此其生根、生長(zhǎng)速度低于扦插苗。本試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，組培苗基本已經(jīng)具有一定的Cd耐受性和低pH 抗性，如果對(duì)組培苗進(jìn)行二次扦插移栽，其在生物量和Cd 富集量等方面應(yīng)當(dāng)有所提高。扦插苗容易大量獲取和擴(kuò)繁，成活率高達(dá)93.1%，生物量和土壤Cd提取量遠(yuǎn)高于組培苗，有很高的工程應(yīng)用價(jià)值。組培苗的育苗成本較高，種植前期生物量和地上部Cd含量低于扦插苗，無(wú)法大規(guī)模應(yīng)用，但從長(zhǎng)期來(lái)看，由于組培苗具有抗早衰特性，可進(jìn)行多次扦插移栽，延緩扦插苗的老化問(wèn)題，因此有一定應(yīng)用潛力。

4 結(jié)論

（1）基施5 mmol·kg檸檬酸或蘋果酸可強(qiáng)化伴礦景天修復(fù)Cd 污染土壤，且基施檸檬酸的土壤Cd 修復(fù)效率高于基施蘋果酸。

（2）基施檸檬酸或蘋果酸可提高伴礦景天根系微區(qū)對(duì)土壤Cd的吸收。

（3）對(duì)于偏酸性重度Cd污染土壤，伴礦景天扦插苗的植物修復(fù)效率顯著高于組培苗。