劉智偉, 張沖, 程宇, 王國(guó)經(jīng), 周丁華*

(1.錦州醫(yī)科大學(xué) 火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心研究生培養(yǎng)基地， 遼寧 錦州 121001； 2.中國(guó)人民解放軍火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心 肝膽外科， 北京 100088； 3. 天津市第一中心醫(yī)院/南開大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 器官移植中心， 天津 300192)

胰腺癌是一種臨床癥狀隱匿、惡性程度高、預(yù)后差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國(guó)男性惡性腫瘤發(fā)病率位列第8，5年生存率僅為7.2%，多數(shù)患者就診時(shí)病情已進(jìn)展至中晚期[1-3]。胰腺癌治療多采取微波消融、射頻消融和高強(qiáng)度聚焦超聲等熱量消融技術(shù)[4]。但傳統(tǒng)熱量消融技術(shù)存在“熱沉效應(yīng)”，使腫瘤組織不能被徹底消融[5]?，F(xiàn)階段，不可逆電穿孔(irreversible electroporation，IRE)技術(shù)是一種新穎的、非熱量的消融方式，通過高壓電場(chǎng)使細(xì)胞膜磷脂雙分子層形成不可閉合的納米級(jí)孔道，同時(shí)加強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性而誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。IRE能有效解決“熱沉效應(yīng)”不能徹底消融腫瘤的弊端，為胰腺癌的消融治療帶來曙光。然而，IRE對(duì)腫瘤細(xì)胞損傷效應(yīng)與脈沖電場(chǎng)強(qiáng)度密切相關(guān)，但具體有效損傷強(qiáng)度國(guó)內(nèi)外學(xué)者仍未達(dá)成共識(shí)[6]。因此，本研究通過體外構(gòu)建人胰腺癌PANC-1細(xì)胞懸液模型，應(yīng)用不同強(qiáng)度脈沖電場(chǎng)對(duì)其進(jìn)行體外處理，探討相關(guān)基因表達(dá)的變化，篩選新型高頻方波電脈沖適宜的脈沖場(chǎng)強(qiáng)參數(shù)，為下一步動(dòng)物載體腫瘤模型消融研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

人胰腺癌PANC-1細(xì)胞(火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心病理科)；CCK-8試劑盒(北京利維寧)；RNA提取試劑盒(北京康為世紀(jì))；Green qPCR Mix(Low ROX)試劑盒(北京博邁德生物公司)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天公司)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(美國(guó)Thermo Scientific公司)；Cleaved-caspase-3 p17 Polyclonal Antibody(江蘇凱基)。

離心機(jī)(Sigma，美國(guó))；顯微鏡(Olympus，日本)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)；PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Perkin Elmer公司)；電擊杯、分子顯影儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.1.2 脈沖裝置

脈沖裝置為本課題組依據(jù)IRE研發(fā)的“新型高頻方波電脈沖系統(tǒng)”。該系統(tǒng)由獨(dú)立電容充放電方式釋放高頻方波電脈沖，電壓強(qiáng)度為0～3 000 V，脈沖寬度為1～100 μs，脈沖頻率為1～90 Hz(圖1)。電壓輸出值、脈沖寬度和脈沖頻率3組參數(shù)可實(shí)現(xiàn)相互獨(dú)立自由調(diào)節(jié)。

A：新型高頻方波電脈沖治療儀；B：自動(dòng)化脈沖控制系統(tǒng)；C：心電監(jiān)護(hù)儀A：New high-frequency square wave electric pulse therapy instrument; B：Automatic pulse control system; C：ECG monitor圖1 新型高頻方波電脈沖系統(tǒng)Figure 1 New high-frequency square wave electric pulse system

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞懸液模型制作

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化3 min，800 r/min離心5 min后棄上清，DMEM溶液重懸混勻細(xì)胞，調(diào)整PANC-1細(xì)胞密度為1×106/mL。吸取800 μL前述細(xì)胞懸液于電擊杯中構(gòu)建體外細(xì)胞懸液模型。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組和脈沖方案設(shè)定

將新型高頻方波電脈沖按照?qǐng)鰪?qiáng)強(qiáng)度不同分為11組。其中0 V/cm作為空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組場(chǎng)強(qiáng)設(shè)定為500 V/cm、750 V/cm、1 000 V/cm、1 250 V/cm、1 500 V/cm、1 750 V/cm、2 000 V/cm、2 250 V/cm、2 500 V/cm和2 750 V/cm。每組場(chǎng)強(qiáng)給予2組高頻方波脈沖(每組10個(gè)脈沖)，固定脈沖寬度100 μs，脈沖頻率1 Hz[7-8]。

合理布局圈舍、廁所、沼氣池、改善坑塘水環(huán)境，建設(shè)高標(biāo)準(zhǔn)養(yǎng)殖坑塘，給養(yǎng)殖生物營(yíng)造一個(gè)最適宜生長(zhǎng)和發(fā)育的生活環(huán)境。促進(jìn)農(nóng)、林、漁良性循環(huán)和符合生態(tài)體系的和諧發(fā)展。

1.2.3 細(xì)胞懸液溫度測(cè)定

紅外線電子測(cè)溫計(jì)分別記錄每組實(shí)驗(yàn)前、后細(xì)胞懸液溫度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

向96孔板中接種實(shí)驗(yàn)后4 h細(xì)胞懸液100 μL，每組參數(shù)共3孔。每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處每孔吸光度并計(jì)算細(xì)胞增殖活力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書對(duì)實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞懸液進(jìn)行檢測(cè)。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞核被染為棕黃色，TUNEL陰性細(xì)胞的細(xì)胞核為藍(lán)色。TUNEL指數(shù)(細(xì)胞凋亡率)是指通過Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算每張切片在200倍鏡下隨機(jī)選取的5個(gè)視野內(nèi)每100個(gè)細(xì)胞中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。

1.2.6 qPCR法測(cè)定實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞Caspase-3、Bcl-2和Ki-67的mRNA表達(dá)

引物序列見表1， 引物由北京天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行合成。按照RNA提取試劑盒說明書提取實(shí)驗(yàn)后1 d細(xì)胞的RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：根據(jù)RNA質(zhì)量濃度吸取500 ng的RNA、1 μL的Oligo (dT)18primer于無酶無菌的EP管后，加無RNase水補(bǔ)至12 μL；配置逆轉(zhuǎn)錄體系5× Reaction Buffer 4 μL、RiboLock RNase Inhibitor (20 U/μL) 1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、RevertAid M-MuLV RT (200 U/μL) 1 μL加入前述EP管中，將EP管震蕩混勻后置于PCR儀中，設(shè)定反應(yīng)程序?yàn)?2 ℃，1 h→70 ℃，5 min。生成的cDNA產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆?。逆轉(zhuǎn)錄及PCR操作步驟參照說明書。Green qPCR Mix(Low ROX)試劑盒說明書配置qPCR反應(yīng)體系于8連管中并置于PCR儀擴(kuò)增，2-ΔΔCt方法計(jì)算各目的mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 Western blot法測(cè)定實(shí)驗(yàn)后Cleaved-Caspase-3、Bcl-2和Ki-67的蛋白表達(dá)

取實(shí)驗(yàn)后4 h 的細(xì)胞懸液50 μL采用預(yù)冷PBS洗滌后，加入200 μL RIPA裂解液冰上裂解5 min，4 ℃下8 000 r/min低溫離心10 min，棄去上清。制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的聚丙烯酰胺凝膠對(duì)樣品進(jìn)行電泳，參數(shù)設(shè)置為濃縮膠電壓80 V、電泳時(shí)間40 min，分離膠電壓120 V、電泳時(shí)間60 min。根據(jù)濕轉(zhuǎn)法操作流程對(duì)凝膠板進(jìn)行PVDF轉(zhuǎn)膜，設(shè)置恒定電流為250 mA，電轉(zhuǎn)持續(xù)時(shí)間為90 min。隨后經(jīng)麗春紅染色后，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂牛奶室溫下封閉反應(yīng)1 h。分別加入測(cè)定蛋白一抗Cleaved-Caspase-3(VCleaved-Caspase-3∶V抗體稀釋液=1∶5 000)、Bcl-2(VBcl-2∶V抗體稀釋液=1∶2 000)、Ki-67(VKi-67∶V抗體稀釋液=1∶2 000)4 ℃孵育過夜后，Tris-HCl緩沖液(TBST)漂洗3次，每次洗滌時(shí)間10 min。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(V二抗∶V抗體稀釋液=1∶1 500)避光孵育1 h。顯影液處理進(jìn)行目的蛋白顯影，通過各條帶灰度分析蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞懸液溫度變化情況

實(shí)驗(yàn)前后各組細(xì)胞懸液溫度升高不明顯(圖2)。對(duì)各組實(shí)驗(yàn)前后溫度經(jīng)單因素方差分析，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.010、1.333，P=1.000、0.237)。對(duì)各組組內(nèi)實(shí)驗(yàn)前后溫度進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。提示新型高頻方波電脈沖作用下，熱效應(yīng)在細(xì)胞損傷中無明顯作用。

圖2 實(shí)驗(yàn)前后細(xì)胞懸液溫度Figure 2 Temperature of cell suspension before and after experiment

2.2 細(xì)胞增殖活力變化

對(duì)細(xì)胞增殖活力行單因素方差分析和多重比較檢驗(yàn)：各組細(xì)胞增殖活力不全相同(F=2 666.248，P=0.000)；對(duì)500～1 250 V/cm的細(xì)胞增殖活力兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P=0.000)，提示細(xì)胞增殖活力隨電場(chǎng)強(qiáng)度的升高呈下降趨勢(shì)；2 500 V/cm和2 750 V/cm組的細(xì)胞增殖活力降至最低(P=0.323，圖3)。

1)P<0.05圖3 實(shí)驗(yàn)后4 h細(xì)胞增殖活力Figure 3 Cell proliferation activity of PANC-1 cells at 4 h after experiment

2.3 脈沖細(xì)胞凋亡情況

TUNEL染色結(jié)果顯示空白對(duì)照組的細(xì)胞被染為藍(lán)紫色，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核被染為棕黃色并出現(xiàn)核固縮等細(xì)胞凋亡表現(xiàn)(圖4B)。對(duì)細(xì)胞凋亡率經(jīng)單因素方差分析和多重比較：各組細(xì)胞凋亡率不全相同(F=864.182，P=0.000)；500～1 000 V/cm的凋亡率兩兩比較，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P=0.000)，提示細(xì)胞凋亡率隨電場(chǎng)強(qiáng)度的增加呈上升趨勢(shì)；凋亡率在1 250～1 500 V/cm達(dá)到峰值(P=0.826)；1 750～2 750 V/cm的細(xì)胞凋亡率兩兩比較，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P=0.000)，此時(shí)各組細(xì)胞凋亡率隨電場(chǎng)強(qiáng)度升高呈下降趨勢(shì)。

A：不同脈沖電場(chǎng)強(qiáng)度細(xì)胞凋亡率比較，1)P<0.05；B：實(shí)驗(yàn)當(dāng)日PANC-1細(xì)胞TUNEL染色(20×)，其中0 V/cm圓圈所示TUNEL陰性細(xì)胞，箭頭所示TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞A：Comparison of cell apoptosis rate with different pulse electric field intensity, 1) P<0.05; B：TUNEL staining of PANC-1 cells on the day of experiment(20×), TUNEL-negative cells were showed with circles and TUNEL-positive cells were showed with arrows in the subgraph of 0 V/cm圖4 實(shí)驗(yàn)當(dāng)日PANC-1細(xì)胞凋亡率和TUNLE染色Figure 4 Apoptosis rate and TUNLE staining of PANC-1 cell on the day of experiment

2.4 Caspase-3、Bcl-2、Ki-67 mRNA的表達(dá)變化

各組細(xì)胞Caspase-3、Bcl-2和Ki-67mRNA相對(duì)表達(dá)量見圖5。實(shí)驗(yàn)組Bcl-2、Ki-67mRNA相對(duì)表達(dá)量較空白對(duì)照組明顯下降(F=427.620、1 265.143，P=0.000、0.000)；500～1 250 V/cm的Bcl-2、Ki-67mRNA相對(duì)表達(dá)量隨高頻方波電場(chǎng)強(qiáng)度的增加呈下降趨勢(shì)(均P=0.000，均P=0.000)；2 250～2 750 V/cm的Bcl-2mRNA相對(duì)表達(dá)量下降至最低(均P>0.05)；1 500～2 750 V/cm的Ki-67mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行兩兩比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，Ki-67mRNA相對(duì)表達(dá)量在場(chǎng)強(qiáng)大于1 500 V/cm之后降至最低并保持相對(duì)穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)組Caspase-3mRNA相對(duì)表達(dá)量較空白對(duì)照組明顯升高(F=363.519，P=0.000)；500～1 250 V/cm的相對(duì)表達(dá)量隨高頻方波電場(chǎng)強(qiáng)度的升高呈上升趨勢(shì)(均P<0.05)；1 250～1 750 V/cm的Caspase-3mRNA相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值(均P>0.05)；1 750～2 250 V/cm 的Caspase-3mRNA相對(duì)表達(dá)量隨電場(chǎng)強(qiáng)度的升高呈下降趨勢(shì)(均P<0.05)。

A:Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量;B.Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量;C.Ki-67 mRNA相對(duì)表達(dá)量。 1)P<0.05A: The relative mRNA expression of Caspase-3; B: The relative mRNA expression of Bcl-2; C: the relative mRNA expression of Ki-67. 1)P<0.05圖5 實(shí)驗(yàn)后第1天PANC-1細(xì)胞 mRNA相對(duì)表達(dá)量Figure 5 Relative mRNA expression of PANC-1 cells on day 1 after experiment

2.5 Cleaved-caspase-3、Bcl-2、Ki-67的蛋白表達(dá)情況

以β-actin為內(nèi)參，與對(duì)照組相比，各蛋白表達(dá)水平與脈沖強(qiáng)度存在相關(guān)性(圖6)。實(shí)驗(yàn)組活化后的Caspase-3(Cleaved-caspase-3)蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)升高(P<0.05)； Cleaved-caspase-3表達(dá)水平在1 500～1 750 V/cm時(shí)達(dá)到最高。實(shí)驗(yàn)組Ki-67、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

A：Western blot檢測(cè)的Cleaved-caspase-3、Bcl-2及Ki-67蛋白表達(dá)情況；B：Ki-67蛋白相對(duì)表達(dá)量；C：Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量；D：Cleaved-caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量。 1)P<0.05A: The expressions of Cleaved-caspase-3, Bcl-2 and Ki-67 protein detected by Western blot; B: The relative expression of Ki-67 protein; C: The relative expression of Bcl-2 protein; D: The relative expression of Cleaved-caspase-3 protein. 1)P<0.05圖6 實(shí)驗(yàn)后PANC-1細(xì)胞Cleaved-caspase-3、Bcl-2及Ki-67蛋白表達(dá)Figure 6 Expression of Cleaved-caspase-3, Bcl-2 and Ki-67 proteins in PANC-1 cells after experiment

3 討論

Copelan等[9]研究指出，細(xì)胞所處環(huán)境溫度超過56 ℃就會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞蛋白質(zhì)變性并發(fā)生凝固性壞死。本研究中，實(shí)驗(yàn)后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞懸液的溫度為(27.26±1.31)℃，各組實(shí)驗(yàn)前后溫度升高不明顯，表明新型高頻方波電脈沖對(duì)PANC-1細(xì)胞的損傷效應(yīng)并非源于熱效應(yīng)，這與熱量消融方式誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的機(jī)制不同。

CCK-8實(shí)驗(yàn)提示，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖活力隨電場(chǎng)強(qiáng)度的升高逐漸下降，2 500 V/cm時(shí)細(xì)胞增殖活力降至最低(19.99±1.84)%。本課題組前期研究觀察到人肝癌Hep-G2細(xì)胞在2 500 V/cm的細(xì)胞增殖活力僅為(19.00±5.61)%[10]，提示新型高頻方波電脈沖對(duì)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞存在某種損傷效應(yīng)。進(jìn)一步通過TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡反應(yīng)，并且細(xì)胞凋亡率與電場(chǎng)強(qiáng)度呈正相關(guān)，細(xì)胞凋亡率在1 250～1 500 V/cm達(dá)到最高。但是，細(xì)胞凋亡率隨脈沖電場(chǎng)強(qiáng)度的增加而呈現(xiàn)緩慢下降，結(jié)合細(xì)胞增殖活力情況，推測(cè)較高的脈沖電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞的損傷可能不僅僅是凋亡效應(yīng)。Batista等[11]認(rèn)為IRE通過各種生理和病理過程誘導(dǎo)細(xì)胞自我破壞引發(fā)細(xì)胞凋亡，并表現(xiàn)出細(xì)胞核萎縮、染色質(zhì)破碎、凝集和凋亡小體形成等凋亡細(xì)胞典型的形態(tài)學(xué)變化。李成祥等[6]研究IRE在不同電場(chǎng)強(qiáng)度的窗口效應(yīng)中發(fā)現(xiàn)，較高的脈沖電場(chǎng)在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)也出現(xiàn)細(xì)胞壞死現(xiàn)象。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族(cysteine-containing aspartate-specific proteases，Caspase)主要參與細(xì)胞凋亡反應(yīng)。細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)后，激活不同的Caspase啟動(dòng)因子后級(jí)聯(lián)激活下游的各種效應(yīng)分子從而誘導(dǎo)細(xì)胞啟動(dòng)凋亡，Caspase-3屬于下游效應(yīng)分子[12-13]。Cleaved-caspase-3通過裂解DNA酶抑制物而激活半胱氨酸蛋白酶激活的DNA酶，致使細(xì)胞內(nèi)DNA斷裂而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14-15]。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組Caspase-3mRNA相對(duì)表達(dá)量較空白對(duì)照組不同程度地升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞實(shí)驗(yàn)后的Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平也出現(xiàn)不同程度升高。文燕青等[16]研究指出，人卵巢漿液性囊腺癌SKOV3細(xì)胞經(jīng)IRE處理2 h后Caspase-3相對(duì)表達(dá)量得到顯著增加。另外，破壞Bax/Bcl-2平衡或降低任何抗凋亡分子與促凋亡分子的結(jié)合能力對(duì)癌癥治療具有重要意義[17]。本研究顯示，Bcl-2mRNA的相對(duì)表達(dá)量較空白對(duì)照組明顯下降，其蛋白表達(dá)水平也較空白對(duì)照組不同程度下降。研究指出，經(jīng)IRE消融的腫瘤組織Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bcl-2/Bax數(shù)值降低，并激活Caspase-3經(jīng)由線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[18-19]。Guo等[20]報(bào)道經(jīng)IRE消融的人黑色素瘤A375細(xì)胞，Bax表達(dá)明顯增加，Bcl-2明顯減少，能有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，當(dāng)PANC-1細(xì)胞受到高頻方波電脈沖作用后，細(xì)胞內(nèi)Caspase-3基因表達(dá)增加，Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白含量下降，Bax/Bcl-2數(shù)值升高，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

Ki-67在細(xì)胞間期是染色質(zhì)正常分布和組成核仁所必需的，在染色體核仁組裝過程中起保護(hù)鞘作用，在核包膜解體后能有效防止細(xì)胞染色體聚集，可以預(yù)測(cè)腫瘤增殖指數(shù)和惡性潛能[21]。本研究發(fā)現(xiàn)Ki-67基因相對(duì)表達(dá)量和其蛋白表達(dá)量均較空白對(duì)照組出現(xiàn)不同度下降。Zhang等[22]通過對(duì)乳腺癌 MCF-7細(xì)胞進(jìn)行IRE實(shí)驗(yàn)指出，實(shí)驗(yàn)組Ki-67染色陽(yáng)性率(27.5%)較對(duì)照組明顯降低。本研究中，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Ki-67表達(dá)的降低和細(xì)胞增殖能力的降低，證實(shí)新型高頻方波電實(shí)驗(yàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制增殖作用。

較高的脈沖電場(chǎng)(大于2 250 V/cm)對(duì)細(xì)胞的損傷主要表現(xiàn)為細(xì)胞壞死而不是凋亡，壞死細(xì)胞由于出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞損傷和功能障礙引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)，形成消融局部潰瘍；較低的脈沖電場(chǎng)強(qiáng)度引起的細(xì)胞凋亡則表現(xiàn)為細(xì)胞膜相對(duì)完整，機(jī)體通過吞噬作用吞噬凋亡細(xì)胞，在腫瘤消融過程中安全性更高[6,23]。

綜上，本研究觀察到新型高頻方波電脈沖誘導(dǎo)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞可增加Caspase-3基因的表達(dá)、Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)以及降低Bcl-2的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Ki-67表達(dá)的降低證明腫瘤細(xì)胞增殖能力降低；初步篩選出最佳場(chǎng)強(qiáng)參數(shù)設(shè)定為1 250～1 500 V/cm時(shí)，凋亡效應(yīng)最明顯。

作者貢獻(xiàn)聲明

劉智偉：提出研究思路和框架，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)、撰寫論文、修改論文；張沖：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)；程宇：提出研究思路和框架，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、修改論文；王國(guó)經(jīng)：提供實(shí)驗(yàn)儀器、資金支持；周丁華：提出研究思路和框架、提供實(shí)驗(yàn)儀器、資金支持、修改論文。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。