李雪麗　曹彩霞　宋潔　馮文靜　鐘麗娜　楊學(xué)成

[摘要]目的運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析篩選嗜鉻細(xì)胞瘤/副神經(jīng)節(jié)瘤（PCPG）核心差異表達(dá)基因（DEGs）。方法通過基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（GEO）獲取GSE60458微陣列芯片數(shù)據(jù)，應(yīng)用在線NetworkAnalyst 3.0系統(tǒng)鑒定DEGs，KOBAS v3.0平臺分析預(yù)測DEGs的作用通路，STRING v11.0工具繪制核心DEGs蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，GEPIA2平臺驗證核心DEGs表達(dá)水平。結(jié)果從GSE60458芯片中共獲得1 903個DEGs，其中表達(dá)上調(diào)基因864個，表達(dá)下調(diào)基因1 039個。GO分析共富集1 593條通路，KEGG通路分析共富集145條通路。10個核心DEGs（CYP11A1、CYP11B1、CYP11B2、CYP17A1、HSD3B2、HSD3B1、STAR、SULT2A1、NR4A1、EGR4）主要參與甾類激素的生物合成過程。與Normal組相比較，PCPG組病人CYP11A1、CYP11B1、CYP11B2、CYP17A1、HSD3B2、STAR和SULT2A1等7個核心DEGs的表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.05），而HSD3B1、NR4A1和EGR4等3個核心DEGs表達(dá)水平無明顯變化。結(jié)論本研究篩選出的核心DEGs可能影響甾類激素的生物合成，參與調(diào)控PCPG的發(fā)生發(fā)展。

[關(guān)鍵詞]嗜鉻細(xì)胞瘤;副神經(jīng)節(jié)瘤;基因表達(dá);計算生物學(xué)

[中圖分類號]R736.6;R730.264[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號]2096-5532（2022）02-0183-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.063[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版]https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20220320.1549.004.html;2022-03-2210：11：14

BIOINFORMATICS ANALYSIS AND IDENTIFICATION OF CORE DIFFERENTIALLY EXPRESSED GENES IN PHEOCHROMOCYTOMA/PARAGANGLIOMA

LI Xueli， CAO Caixia， SONG Jie， FENG Wenjing， ZHONG Lina， YANG Xuecheng （Department of Endocrinology and Metabolism， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the core differentially expressed genes （DEGs） in pheochromocytoma/paraganglioma （PCPG） based on bioinformatics. MethodsGene Expression Omnibus database was used to obtain GSE60458 microarray data. The online NetworkAnalyst 3.0 system was used to identify DEGs. KOBAS v3.0 was used for bioinformatics analysis to predict the pathway of DEGs， and STRING v11.0 was used to plot the protein-protein interaction network of core DEGS. The GEPIA2 platform was used to verify the expression level of core DEGs. ResultsA total of 1 903 DEGs were obtained from GSE60458 microarray， among which there were 864 upregulated genes and 1 039 downregulated genes. A total of 1 593 pathways were enriched by gene ontology analysis and 145 pathways were enriched by KEGG pathway analysis. Ten core DEGs （CYP11A1， CYP11B1， CYP11B2， CYP17A1， HSD3B2， HSD3B1， STAR， SULT2A1， NR4A1， and EGR4） were mainly involved in ste-roid hormone biosynthesis. Compared with the Normal group， the PCPG group had significant reductions in the expression levels of the 7 core DEGs of CYP11A1， CYP11B1， CYP11B2， CYP17A1， HSD3B2， STAR and SULT2A1 （P<0.05）， while there were no significant changes in the expression levels of the 3 core DEGs of HSD3B1， NR4A1， and EGR4. ConclusionThe core DEGs screened out in this study may affect steroid hormone biosynthesis and participate in regulating the development and progression of PCPG.

[KEY WORDS]pheochromocytoma; paraganglioma; gene expression; computational biology

作為繼發(fā)性高血壓常見原因之一的嗜鉻細(xì)胞瘤/副神經(jīng)節(jié)瘤（PCPG）是一種少見的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，國內(nèi)尚沒有確切的患病率統(tǒng)計[1]。臨床研究顯示，有15%～17%的PCPG可以發(fā)展為轉(zhuǎn)移性PCPG，而轉(zhuǎn)移性PCPG治療選擇有限，預(yù)后差，通常5年存活率不到50%[2];并且腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致病人死亡的主要原因[3]。世界衛(wèi)生組織已將PCPG歸類到有轉(zhuǎn)移可能的腫瘤類目中，而術(shù)前生化檢測和前期病理結(jié)果均難以判斷PCPG是否具有轉(zhuǎn)移性[4]。國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為，PCPG的發(fā)生發(fā)展在很大程度上是受基因組的改變驅(qū)動，如SDHx和VHL基因的改變導(dǎo)致三羧酸循環(huán)中斷，低氧相關(guān)因子表達(dá)增加[1，5];MAX、RET和TMEM127等抑癌基因激活促進(jìn)腫瘤生長基因的蛋白翻譯[6-7]。PCPG具有較強(qiáng)的遺傳背景，目前已經(jīng)報道了20多個易感基因[8]，約50%的病人存在胚系或體系基因突變[1]。目前常用腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤評分（PASS）和腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤及副神經(jīng)節(jié)瘤分級系統(tǒng)（GAPP）評估PCPG的惡性生物學(xué)特征[9]。但在個體病人中致病基因的改變差異較大，復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移進(jìn)展較慢，僅憑評分結(jié)果、總體生存期和無進(jìn)展生存期，難以精準(zhǔn)地對病人的疾病進(jìn)展進(jìn)行評估。故迫切需要從宏觀角度捕捉可能與該病進(jìn)展相關(guān)的基因變化，綜合相關(guān)基因的內(nèi)在機(jī)制判斷腫瘤的發(fā)生發(fā)展，為未來開展基因信息監(jiān)測、實現(xiàn)精準(zhǔn)干預(yù)提供研究基礎(chǔ)。

近年來，微陣列分析和測序技術(shù)已經(jīng)成為篩選致病基因，識別具有診斷、治療價值的生物標(biāo)志物的有效技術(shù)，如LIN等[10]的研究通過微陣列芯片確定了KCNQ1和SCN2A是PCPG中的異常甲基化基因。生物信息學(xué)分析為高通量測序技術(shù)提供了快速有效的分析途徑，其與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)，COX4I2和PLAT蛋白與PCPG供血高度相關(guān)[11]。NCBI基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（GEO）可以提供大量針對各種人類腫瘤的微陣列分析數(shù)據(jù)和下一代測序數(shù)據(jù)，儲存了大量未被挖掘的差異表達(dá)基因（DEGs）。探究與PCPG相關(guān)的特異性DEGs及其可能參與的病理功能有助于更好地理解PCPG的進(jìn)展。本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫的微陣列芯片數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)分析篩選核心DEGs并探討其可能的分子機(jī)制，以期為PCPG的發(fā)生發(fā)展提供新的研究視角。

1資料與方法

1.1微陣列芯片初始數(shù)據(jù)的獲取

通過GEO數(shù)據(jù)庫獲取PCPG基因微陣列芯片（GSE60458）數(shù)據(jù)，其中共包含62 976個探針的初始數(shù)據(jù)，來自于12例PCPG組織樣本（PCPG組，良性9例，惡性3例）和3例正常腎上腺髓質(zhì)組織樣本（Normal組）。并且通過GPL13607平臺（Agilent-028004 SurePrint G3 Human GE 8x60K Microarray）識別探針信號對應(yīng)的基因名稱。

1.2DEGs的篩選

利用在線NetworkAnalyst 3.0系統(tǒng)，對微陣列芯片初始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和背景校正處理。使用該系統(tǒng)的Limma包對PCPG組和Normal組做層次聚類分析，以log2|Fold Change|>2且P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選DEGs，以熱圖顯示DEGs表達(dá)譜，以火山圖展示所有DEGs的顯著性差異。并以DEGs為變量進(jìn)行主成分分析（PCA），觀察PCPG組和Normal組樣本的差異。

1.3DEGs功能預(yù)測

為探究DEGs可能參與的通路，將全部DEGs輸入KOBAS v3.0（KEGG Orthology Based Annotation System v3.0）線上數(shù)據(jù)平臺，進(jìn)行在線GO（Gene Ontology）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes）通路富集分析，以P<0.05和錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<0.05為基因富集通路有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4核心DEGs篩選

使用STRING v11.0工具將表達(dá)差異最大的40個DEGs進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，將連接于模塊中的基因作為核心DEGs，并將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化。

1.5核心DEGs表達(dá)水平驗證

為驗證GSE60458微陣列芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性，在GEPIA2平臺上TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中獲取182例PCPG標(biāo)本（Tumor組）和3例正常對照標(biāo)本（Normal組），分析兩組核心DEGs的表達(dá)情況。使用Origin 2016軟件構(gòu)建生物信息學(xué)分析結(jié)果圖，采用雙側(cè)t檢驗統(tǒng)計組間的差異，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1PCPG差異基因表達(dá)及分布特征

PCA顯示，DEGs將兩組樣本從兩個主成分維度（PC1、PC2）完全分離，說明DEGs表達(dá)模式具有特異性，可用于完全區(qū)分PCPG組織和正常腎上腺組織。同時觀察到PCPG組9例良性腫瘤樣本和3例惡性腫瘤樣本未能完全分離，說明良惡性腫瘤組織DEGs表達(dá)模式的特異性差。見圖1。

分析GSE60458芯片中的所有基因的表達(dá)結(jié)果，DEGs共有1 903個（圖2），其中表達(dá)上調(diào)基因864個，下調(diào)基因1 039個（圖3）。表達(dá)上調(diào)DEGs前10位依次為EGR、SCRT2、C1QL1、SOHLH1、CD163L、lincRNA：chr5：1731、CHRNA4、TLX3、NR4A1和ENST0000031680，表達(dá)下調(diào)DEGs前10位依次為HSD3B1、HSD3B2、MRAP、AADAC、CYP11B2、GSTA5、LOC391081、CYP11B1、MGST1和KCNK2（圖4）。

2.2DEGs的GO和KEGG富集分析

GO富集分析結(jié)果顯示，DEGs富集于1 593條通路，DEGs富集度最大的5條通路分別為蛋白結(jié)合（Protein binding）、細(xì)胞質(zhì)膜（Plasma membrane）、胞外區(qū)（Extracellular region）、細(xì)胞膜的有機(jī)構(gòu)成（Integral component of membrane）和細(xì)胞外間隙（Extracellular space）。見圖5。KEGG通路富集于145條通路，其中富集度最大的5條通路分別為代謝途徑（Metabolic pathways）、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）、病毒蛋白與細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體的相互作用（Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor）、癌癥通路（Pathways in cancer）和藥物代謝-細(xì)胞色素P450（Drug metabolism-cytochrome P450）。見圖6。

2.3核心DEGs篩選

本研究采用STRING v11.0工具軟件對表達(dá)差異最大的40個DEGs進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，并將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化。PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，CYP11A1、CYP11B1、CYP11B2、CYP17A1、HSD3B2、EGR4、STAR、SULT2A1、NR4A1和HSD3B1等10個基因位于緊密連接的模塊中，認(rèn)定為核心DEGs（圖7）。該模塊由10個節(jié)點和32條連接線組成，結(jié)合GO和KEGG富集分析結(jié)果，CYP11B1、CYP11B2、CYP11A1、CYP17A1、HSD3B1和HSD3B2基因參與甾類激素生物合成（Steroid hormone biosynthesis），CYP11B1、CYP11B2基因參與氧化還原過程（Oxidation-reduction process），CYP11B1、CYP11B2和HSD3B2基因共同參與鈣離子結(jié)合（Calcium ion binding），CYP11B1、HSD3B2基因以及HSD3B1基因參與代謝通路（Metabolic pathways），NR4A1基因參與MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）。

2.4核心DEGs表達(dá)水平驗證

利用TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫，對GSE60458芯片的分析結(jié)果進(jìn)行驗證。與Normal組相比，Tumor組病人CYP11A1、CYP11B1、CYP11B2、CYP17A1、HSD3B2、STAR和SULT2A1等7個核心DEGs的表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.05），與GSE60458數(shù)據(jù)集的結(jié)果相同;而HSD3B1、NR4A1和EGR4等3個核心DEGs表達(dá)水平無明顯變化，與GSE60458數(shù)據(jù)集的結(jié)果相似。見圖8。

探究腫瘤組織和正常組織之間的差異是腫瘤研究的主要內(nèi)容。PCPG是少見的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，由于臨床數(shù)據(jù)及組織標(biāo)本難以大量獲得，這限制了科研人員對該病的探究。腫瘤基因微陣列芯片中包含了大量有潛在研究價值的信息，生物信息學(xué)的運(yùn)用可以從宏觀角度對有潛在研究價值的基因進(jìn)行篩選，進(jìn)而加快研究進(jìn)程。但隨著高通量技術(shù)的普及和大數(shù)據(jù)庫的發(fā)展，“數(shù)據(jù)泛濫”成為生物信息學(xué)分析的一個難點。而PCA可以將多維度數(shù)據(jù)有效地降維分析[12]。本研究對所有樣本進(jìn)行了PCA，觀察到PCPG組和Normal組可以從兩個主成分維度完全分離，說明PCPG組織和正常腎上腺組織在基因表達(dá)模式上具有顯著的差異。而PCPG組9例良性腫瘤樣本和3例惡性腫瘤樣本則未能完全分離，提示PCPG良惡性組織基因表達(dá)模式差異較小。日本學(xué)者統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，有60%的惡性PCPG最初被診斷為良性PCPG[4]，本研究PCA結(jié)果也從側(cè)面驗證了這一事實。

本研究從GSE60458芯片數(shù)據(jù)集中共確定了1 903個DEGs，表明腫瘤的形成過程是一個涉及癌基因、抑癌基因和其他基因改變的復(fù)雜過程。DEGs通路富集分析進(jìn)一步表明，DEGs主要參與了與腫瘤相關(guān)的生物學(xué)過程，如胞外外泌體、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號、Ras信號通路以及MAPK信號通路等。有研究發(fā)現(xiàn)，PCPG病人的循環(huán)外泌體中存在雙鏈DNA片段，且外泌體DNA片段與腫瘤細(xì)胞易感基因具有相同的突變[13];NRF2基因激活可以通過抑制氧化應(yīng)激和促進(jìn)腫瘤炎癥來降低癌癥風(fēng)險[14];白細(xì)胞介素-33（IL-33）通過調(diào)節(jié)趨化因子，招募、激活固有免疫細(xì)胞，從而創(chuàng)造促腫瘤環(huán)境[15];在肺癌研究中，Treg細(xì)胞中IC（Immune checkpoint）分子表達(dá)水平升高，程序性死亡受體1（PD-1）表達(dá)增加，表現(xiàn)出強(qiáng)大的抑制活性[16]。近年來，PCPG病因相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)使轉(zhuǎn)移性PCPG的診斷和治療取得了重大進(jìn)展，為了精準(zhǔn)地對疾病進(jìn)展進(jìn)行個體化基因信息監(jiān)測，還需要更為高效的分析技術(shù)。

由于篩選出的1 903個DEGs的信息眾多，為精確研究范圍，本研究通過STRING v11.0工具將表達(dá)差異最大的40個DEGs進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果顯示，10個核心DEGs存在著直接或間接地相互

作用。表明核心基因表達(dá)水平的變化有可能干擾PCPG的發(fā)生和發(fā)展。通過TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫驗證10個核心基因表達(dá)水平，結(jié)果與GSE60458芯片結(jié)果一致。其中HSD3B1、NR4A1和EGR4基因的表達(dá)水平兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是由于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中正常對照組納入的樣本數(shù)量有限，數(shù)據(jù)存在偏移，提示仍需收集腫瘤標(biāo)本和臨床數(shù)據(jù)，進(jìn)一步驗證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本文富集分析結(jié)果顯示，CYP11B1、CYP11B2、CYP11A1、CYP17A1、HSD3B1、HSD3B2等基因共同參與甾類激素的生物合成。類固醇生成酶分為細(xì)胞色素P450和羥基類固醇脫氫酶/酮類固醇還原酶兩類，包括CYP11A1、CYP11B1、CYP11B2、HSD3B2、HSD11B1、HSD11B2等[17-18]。甾類激素生物合成是在多種酶和輔助因子的參與下，由膽固醇經(jīng)多步酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化為具有生物活性的甾類激素，涉及多種細(xì)胞的生理功能。膽固醇是免疫細(xì)胞膜的基本脂質(zhì)成分，可以通過T細(xì)胞獲得，并參與細(xì)胞激活、增殖、代謝等[19]。已有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤膽固醇通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路[20]，或誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞功能衰竭[21]，使抗腫瘤免疫失活;氧甾醇通過與核肝X受體（LXR）α和LXRβ相互作用，發(fā)揮內(nèi)源性脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)作用，招募促血管生成和免疫抑制的中性粒細(xì)胞[22]，建立促腫瘤微環(huán)境;腺體外類固醇激素合成失調(diào)降低了免疫細(xì)胞自身的抗腫瘤能力[23]。腫瘤細(xì)胞可通過破壞免疫細(xì)胞功能，造成抗腫瘤免疫反應(yīng)鈍化，從而逃避免疫殺傷。此外，轉(zhuǎn)錄因子也可能參與抗腫瘤免疫。NR4A1基因位于12號染色體，有12個外顯子，編碼核轉(zhuǎn)錄因子。有文獻(xiàn)報道，NR4A1轉(zhuǎn)錄因子在耐受性T細(xì)胞中表達(dá)增加，缺失NR4A1則可降低T細(xì)胞的耐受性，增強(qiáng)對腫瘤的免疫力[24]。本研究芯片分析結(jié)果顯示，NR4A1表達(dá)上調(diào)，通路富集顯示NR4A1參與MAPK信號通路，可能通過影響PCPG激酶信號通路[1]，參與腫瘤的發(fā)生。

本研究分析報告了兩個在PCPG中鮮有研究的DEGs。SOHLH1基因位于9號染色體，其編碼蛋白具有轉(zhuǎn)錄因子的功能。LIU等[25]研究發(fā)現(xiàn)，Sohlh1蛋白在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)下調(diào)，且與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性程度呈負(fù)相關(guān)。體外實驗進(jìn)一步確定了Sohlh1通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[25]。Wnt信號通路在PCPG中已有深入的研究，如CSDE1體細(xì)胞突變及MAML3的體細(xì)胞基因融合激活Wnt和Hedgehog信號通路[3]，使PCPG表現(xiàn)為強(qiáng)侵襲性。SOHLH1基因表達(dá)上調(diào)，可能參與PCPG的轉(zhuǎn)移，提示該基因可能成為腫瘤行為的預(yù)測因子。SCRT2基因編碼Scratch家族轉(zhuǎn)錄抑制因子2，位于20號染色體。研究發(fā)現(xiàn)，Scratch1和Scratch2由黏附分子E-cadherin介導(dǎo)，通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制，參與神經(jīng)上皮細(xì)胞向神經(jīng)元遷移或向中間神經(jīng)元祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化[26]。但SCRT2在PCPG中的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，本研究篩選出的10個核心DEGs可能影響甾類激素的生物合成，參與調(diào)控PCPG的發(fā)生發(fā)展，這為預(yù)測PCPG的潛在生物標(biāo)志物提供了研究依據(jù)。

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（本文編輯馬偉平）