李榮軍 游忠嵐 徐春霞 王 健 楊小麗 向洪志 楊偉興

原發(fā)性肝癌（以下簡(jiǎn)稱肝癌）是常見(jiàn)的惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)肝癌的發(fā)病率和病死率呈持續(xù)升高趨勢(shì)，且患者的預(yù)后較差，每年約有100 萬(wàn)例肝癌患者死亡[1-3]。目前手術(shù)切除仍是治療肝癌的主要方法，但多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期或已發(fā)生轉(zhuǎn)移從而失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，而化學(xué)治療因受到多種因素（如藥物不良反應(yīng)和耐藥性）的影響而效果有限[4]。因此，亟需通過(guò)探究肝癌發(fā)病機(jī)制和分子靶點(diǎn)以期尋找有效且安全的肝癌治療策略。

LIM基因主要參與調(diào)控細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白、蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá), 并在胚胎發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[5]，其還參與了多種腫瘤的發(fā)生[6]。LHX3 基因?yàn)長(zhǎng)IM同源盒基因家族成員，在垂體和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中起著關(guān)鍵的基因調(diào)控作用[7]。研究表明LHX3 是預(yù)測(cè)晚期肝癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物[8]。本研究通過(guò)檢測(cè)肝癌患者腫瘤及癌旁組織中LHX3 表達(dá)水平，并構(gòu)建移植瘤裸鼠模型，從而探究沉默LHX3 表達(dá)對(duì)肝癌發(fā)生、發(fā)展的影響，并初步探究了其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 患者的一般資料 收集2017 年1 月至2019年1 月在瀘州市中醫(yī)醫(yī)院接受手術(shù)治療的54 例肝癌患者的腫瘤組織及癌旁組織（距離腫瘤邊緣＞3 cm）。54 例患者中，男性39 例，女性15 例，年齡35～68 歲，平均年齡為（44.81±5.36）歲，所有患者均未曾接受放射治療、化學(xué)治療、免疫治療及靶向藥物治療。按照Edmondson-Steiner 病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，分為Ⅰ級(jí)9 例，Ⅱ級(jí)13 例，Ⅲ級(jí)23 例，Ⅳ級(jí)9 例。按照肝癌分化程度，分為高分化17 例，中分化22 例，低分化15 例。上述病理診斷均由2 位及以上經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生判定。所有患者均簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 選取30 只4 周齡SPF 級(jí)雌性BALB/c 裸鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量為18～20 g，用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食，光照與黑暗環(huán)境12 h 交替。人肝癌細(xì)胞株HepG2 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（上海）。主要試劑：Sonic hedgehog（Shh）信號(hào)通路激動(dòng)劑Purmorphamine、Polybrene 試 劑 購(gòu) 自 美 國(guó)Sigma 公司，免疫組織化學(xué)染色試劑盒和H-E 染色試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司，總RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司，CCK-8 試劑盒、TUNEL 試劑盒和Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒和PVDF 膜購(gòu)自上海碧云天生物研究所，兔抗LHX3、Shh、Gli-l 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santacruz 公司，兔抗GAPDH 單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG 單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物公司。引物合成、NC-shRNA 和LHX3-shRNA 慢病毒載體的構(gòu)建、包裝及效價(jià)測(cè)定由上海吉?jiǎng)P基因公司完成。

1.2 方法

NC-shRNA 組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照NC-shRNA 慢病毒質(zhì)粒）、LHX3-shRNA 組（轉(zhuǎn)染LHX3-shRNA 慢病毒質(zhì)粒沉默LHX3）和LHX3-shRNA＋Pur 組（轉(zhuǎn)染LHX3-shRNA 慢病毒質(zhì)粒后用終濃度為1 μmol/L 的Purmorphamine 試劑處理24 h）。轉(zhuǎn)染時(shí)，當(dāng)細(xì)胞感染復(fù)數(shù)（MOI）為100 時(shí)加入5 μg/mL 的Polybrene試劑，培養(yǎng)12 h 后更換為新鮮培養(yǎng)液，用0.5 mg/L的嘌呤霉素持續(xù)篩選，期間每隔1 d 換液1 次，2 周后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法 使用TRIzol 試劑提取各組HepG2 細(xì)胞的總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA 的純度和濃度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以cDNA 為模板，用SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time qPCR）法檢測(cè)LHX3 mRNA 表達(dá)量，以β-actin 作為內(nèi)參。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min，循環(huán)1 次；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，共循環(huán)38 次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算LHX3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.3 CCK-8 法 將各組HepG2 細(xì)胞接種于96 孔板（1×104個(gè)/孔），置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，每孔設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔，分別于24 h、48 h和72 h 時(shí)每孔加入10 μL CCK-8 試劑，混勻后于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測(cè)各孔細(xì)胞的光密度（OD）值。

1.2.4 Transwell 實(shí)驗(yàn) 侵襲實(shí)驗(yàn)：在Transwell 小室上室中加入50 μL 稀釋的Matrigel 膠，置于37 ℃培養(yǎng)箱中40 min。分別吸取100 μL 各組HepG2 細(xì)胞懸液（1×106個(gè)/mL）加入Transwell 小室上室，下室加入600 μL 含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁時(shí)，更換為無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h，取出小室棄去培養(yǎng)液，輕輕擦去上室多余細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS 洗滌后封片，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)侵襲細(xì)胞數(shù)量。遷移實(shí)驗(yàn)：除不加入Matrigel 膠外，其余操作均與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.5 移植瘤裸鼠模型構(gòu)建 將30 只裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、NC-shRNA 組和LHX3-shRNA 組，每組10 只，分別接種HepG2 細(xì)胞、轉(zhuǎn)染NC-shRNA 慢病毒質(zhì)粒的HepG2 細(xì)胞和轉(zhuǎn)染LHX3-shRNA 慢病毒質(zhì)粒的HepG2 細(xì)胞。細(xì)胞用PBS 漂洗并重懸，吸取0.5 mL 細(xì)胞懸液（1×107個(gè)/mL）在裸鼠右側(cè)腋窩皮下接種（全程接種1 次）。接種后第6 天觀察接種部位移植瘤的生長(zhǎng)狀況，接種后第21天處死裸鼠，解剖取出腫瘤，測(cè)量體積并稱重，一部分腫瘤用10%甲醛溶液固定，用于H-E 染色、TUNEL 染色及免疫組織化學(xué)染色以檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡及Gli-1 陽(yáng)性表達(dá)率，另一部分腫瘤置于液氮后保存于-80 ℃冰箱中，用于蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)Shh 和Gli-l 蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 H-E 染色和TUNEL 染色 取各組裸鼠的腫瘤組織，用10%甲醛溶液固定，脫水、透明，石蠟包埋，然后切成4 μm 厚的切片，切片經(jīng)脫蠟、脫水后行H-E 染色，脫水、透明后用中性樹(shù)膠封片，在顯微鏡下（×400）觀察病理變化。將腫瘤組織的石蠟切片脫水后，加入蛋白酶K，37 ℃下孵育30 min，室溫下孵育20 min，PBS 沖洗后在切片上滴加TUNEL 檢測(cè)液，37 ℃孵育1 h，加過(guò)氧化物酶轉(zhuǎn)化劑，37 ℃孵育30 min。在切片上滴加DAB 顯色，用蘇木精復(fù)染，脫水、透明后用中性樹(shù)膠封片，在顯微鏡下（×400）觀察計(jì)數(shù)TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：隨機(jī)選取5 個(gè)視野（取均值），計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算腫瘤細(xì)胞凋亡率（腫瘤細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)量/腫瘤細(xì)胞總數(shù)量×100%）。

1.2.7 免疫組織化學(xué)染色 將切除的患者肝癌組織、癌旁組織及各組裸鼠的腫瘤組織用4%多聚甲醛溶液固定24 h 后以石蠟包埋，切成4 μm 厚度的組織切片，脫蠟復(fù)水后，加入3% H2O2溶液室溫孵育10 min，置于4 ℃枸櫞酸鹽緩沖液中微波高溫進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻，在切片上分別滴加兔抗LHX3 單克隆抗體（1 ∶200）、兔抗Gli-l 單克隆抗體（1 ∶200），4 ℃孵育過(guò)夜。次日棄去一抗，PBS清洗切片后滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1 ∶1 000），室溫孵育1 h，PBS 再次清洗后用DAB 顯色，自來(lái)水沖洗干凈，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，脫水、透明后用中性樹(shù)膠封片，在顯微鏡下（×400）觀察。細(xì)胞質(zhì)著色呈棕黃色至褐色為陽(yáng)性細(xì)胞。隨機(jī)選取5 個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞（取均值），計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比即陽(yáng)性細(xì)胞比例并計(jì)分：＜5%記0 分，5%～25%記1 分，26%～50%記2 分，51%～75%記3 分，＞75%記4分。按照細(xì)胞質(zhì)著色強(qiáng)度計(jì)分：未著色記0 分，淡黃色記1 分，棕黃色記2 分，棕色至棕褐色記3 分。兩項(xiàng)得分的乘積為總分，＜4 分判定為免疫組織化學(xué)陰性表達(dá)，≥4 分判定為免疫組織化學(xué)陽(yáng)性表達(dá)。1.2.8 Western blotting 法 在各組HepG2 細(xì)胞及研磨后的各組裸鼠腫瘤組織中加入預(yù)冷的RIPA 緩沖液裂解后提取總蛋白，采用BCA 法檢測(cè)蛋白水平。取提取的等量各組HepG2 細(xì)胞或各組裸鼠腫瘤組織蛋白樣品，用10% SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，室溫下在5%脫脂奶粉中封閉2 h，加入兔抗LHX3（1 ∶1 000）、 Shh（1 ∶1 000）、Gli-l（1 ∶1 000）單克隆抗體作為一抗，以GAPDH 為內(nèi)參，4 ℃孵育過(guò)夜。次日棄去一抗，TBST 洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1 ∶5 000）作為二抗，室溫孵育1 h，TBST 再次洗膜，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液顯色曝光，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Quantity One 圖像分析軟件分析各條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3S技術(shù)就是包括遙感技術(shù)、地理信息系統(tǒng)和全球定位系統(tǒng)在內(nèi)的三種測(cè)繪技術(shù)的統(tǒng)稱，而且它的研發(fā)是以信息技術(shù)為載體，充分融合了空間技術(shù)、傳感器技術(shù)、衛(wèi)星定位與導(dǎo)航技術(shù)以及計(jì)算機(jī)通訊技術(shù)，作為一種新興的測(cè)繪技術(shù)已經(jīng)在建筑工程測(cè)量中普及[2]。該技術(shù)主要可以實(shí)現(xiàn)采集、處理、管理、分析、表達(dá)、傳播和應(yīng)用空間信息的目的并進(jìn)一步推動(dòng)了社會(huì)和科技的進(jìn)步，對(duì)建筑工程測(cè)量行業(yè)向現(xiàn)代化和自動(dòng)化發(fā)展提供了技術(shù)支撐。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織和癌旁組織中LHX3 表達(dá)水平比較

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，肝癌組織中LHX3 陽(yáng)性表達(dá)率[97.74%（49/54）]較癌旁組織[5.56%（3/54）]明顯升高，兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)肝癌組織和癌旁組織中LHX3 表達(dá)水平 ×100 A 肝癌組織 B 癌旁組織

2.2 各組HepG2 細(xì)胞中LHX3、Shh、Gli-l 表達(dá)水平比較

Real-time qPCR 和Western blotting 檢 測(cè) 結(jié) 果顯示，與空白對(duì)照組比較，LHX3-shRNA 組細(xì)胞中LHX3 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著下降（P均＜0.05），NC-shRNA 組 與 空 白 對(duì) 照 組 細(xì) 胞 中LHX3 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組HepG2 細(xì)胞中LHX3 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（x±s）

圖2 Western blot 法檢測(cè)各組HepG2 細(xì)胞中LHX3 蛋白表達(dá)水平

Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，LHX3-shRNA 組細(xì)胞中Shh、Gli-l 蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著下降（P均＜0.05）；與LHX3-shRNA組 比 較，LHX3-shRNA＋Pur 組 細(xì) 胞 中Shh、Gli-l蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P均＜0.05）；NCshRNA 組與空白對(duì)照組細(xì)胞中Shh、Gli-l 蛋白相對(duì)表達(dá)量的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見(jiàn)表3、圖3。

表3 各組HepG2 細(xì)胞中Shh、Gli-l 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（x±s）

2.3 各組HepG2 細(xì)胞的增殖能力比較

采用CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，LHX3-shRNA 組細(xì)胞在培養(yǎng)48 h、72 h 時(shí)，OD 值均顯著下降（P均＜0.05），表明細(xì)胞的增殖能力均顯著減弱。與LHX3-shRNA組 比 較，LHX3-shRNA＋Pur 組 細(xì) 胞 在 培 養(yǎng)48 h、72 h 時(shí)，OD 值均顯著升高（P均＜0.05），表明細(xì)胞增殖能力均顯著增強(qiáng)。NC-shRNA 組與空白對(duì)照組的各時(shí)間點(diǎn)OD 值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見(jiàn)圖4。

圖3 Western blotting 法 檢 測(cè) 各 組HepG2 細(xì) 胞 中Shh、Gli-l 蛋白表達(dá)水平

圖4 CCK-8 法檢測(cè)各組HepG2 細(xì)胞的增殖能力

2.4 各組HepG2 細(xì)胞侵襲和遷移能力比較

采用Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲和遷移能力，結(jié)果如圖5 所示，HX3-shRNA 組的侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)量均較空白對(duì)照組顯著減少（P均＜0.05），LHX3-shRNA＋Pur 組的侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)量均較LHX3-shRNA 組顯著增加（P均＜0.05），NC-shRNA 組與空白對(duì)照組的侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)量的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

圖5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組HepG2 細(xì)胞的侵襲和遷移能力 ×100 A 侵襲實(shí)驗(yàn) B 遷移實(shí)驗(yàn)

2.5 各組裸鼠的腫瘤體積及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況比較

如圖6A 所示，LHX3-shRNA 組裸鼠腫瘤的體 積 較 對(duì) 照 組 明 顯 縮 小[（0.35±0.02）cm3比（0.96±0.08）cm3，P＜0.05]，濕重較對(duì)照組明顯降低[（0.25±0.02）g 比（0.45±0.04）g，P＜0.05]；對(duì)照組與NC-shRNA 組裸鼠腫瘤的體積及濕重差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

腫瘤組織經(jīng)H-E 染色或TUNEL 染色后在顯微鏡下觀察，如圖6B、6C 所示，對(duì)照組和NC-shRNA 組裸鼠的腫瘤組織中細(xì)胞均較密集，核仁均較厚，細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（8.23±0.68）%比（8.73±0.72）%，P＞0.05]；與對(duì)照組比較，LHX3-shRNA 組裸鼠的腫瘤組織中細(xì)胞密度較低，細(xì)胞凋亡率[（47.97±3.58）%]較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05）。

圖6 各組裸鼠的腫瘤體積和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡情況 A 腫瘤體積 B 腫瘤組織病理圖 H-E 染色×400 C 腫瘤組織病理圖 TUNEL 染色 ×400

2.6 各組裸鼠腫瘤組織中Shh 和Gli-1 蛋白表達(dá)情況比較

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，對(duì)照組和NCshRNA 組裸鼠腫瘤組織染色均較深，著色細(xì)胞均較多，Gli-l 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為（28.42±1.88）%和（30.73±2.27）%，兩組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；LHX3-shRNA 組 裸 鼠 腫 瘤 組 織 染色較淺，著色細(xì)胞較少，Gli-l 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率[（18.24±1.23）%]較對(duì)照組顯著下降（P＜0.05）。見(jiàn)圖7。

圖7 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)各組裸鼠腫瘤組織中Gli-l 蛋白表達(dá)情況 ×200 A 對(duì)照組 B NC-shRNA 組C LHX3-shRNA 組

Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，LHX3-shRNA 組裸鼠腫瘤組織中Shh 和Gli-l 蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著下降（P均＜0.05）；NC-shRNA組與對(duì)照組裸鼠腫瘤組織中Shh 和Gli-l 蛋白相對(duì)表達(dá)量的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見(jiàn)表4、圖8。

表4 各組裸鼠腫瘤組織中Shh 和Gli1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（x±s）

圖8 Western blotting 法檢測(cè)各組裸鼠腫瘤組織中Shh、Gli-l 蛋白表達(dá)量

3 討論

肝癌是全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤，其惡性程度較高，病情進(jìn)展迅速且容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后較差[2]。肝癌的發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)重要的基因和多條信號(hào)通路，具體分子機(jī)制尚不清楚。近年來(lái)學(xué)者們逐漸關(guān)注到肝癌在細(xì)胞和分子水平的病理學(xué)調(diào)控機(jī)制[9]。本研究對(duì)肝癌的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了探討，以期了解參與肝癌發(fā)病的關(guān)鍵因子，為尋找特異性靶向治療方法提供新的思路。

轉(zhuǎn)錄因子是通過(guò)不同的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)影響多種基因表達(dá)的全局性調(diào)控因子，可影響機(jī)體的各種生物學(xué)過(guò)程和功能。LIM同源盒基因是一類具有LIM結(jié)構(gòu)的基因家族，該基因家族編碼的蛋白序列中含有LIM 結(jié)構(gòu)域和同源蛋白序列，其蛋白質(zhì)翻譯產(chǎn)物為L(zhǎng)IM 同源盒轉(zhuǎn)錄因子，可在多種組織發(fā)育和細(xì)胞分化中發(fā)揮作用[5]。LHX3 基因作為L(zhǎng)IM同源盒基因家族的重要成員，是細(xì)胞分化過(guò)程中的主要調(diào)控基因。此外，有研究表明LHX 基因與一些惡性腫瘤相關(guān)。Cha 等[10]的研究發(fā)現(xiàn)LHX4 表達(dá)在結(jié)直腸癌中顯著上調(diào)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，并可促使轉(zhuǎn)錄因子4（TCF4）與β-連環(huán)蛋白（β-catenin）結(jié)合形成穩(wěn)定的LHX4/TCF4/β-catenin 復(fù)合物，從而激活下游靶標(biāo)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路以促進(jìn)腫瘤發(fā)展。Dietrich 等[11]的研究表明LHX3 的DNA甲基化與乳腺癌明顯相關(guān)。在本研究中，肝癌組織中LHX3 的表達(dá)水平顯著升高，表明LHX3 可能參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展；進(jìn)一步通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)沉默LHX3 表達(dá)以探究其對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，研究結(jié)果表明，在沉默LHX3 表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移均明顯受到抑制。給予裸鼠接種沉默LHX3 表達(dá)的肝癌細(xì)胞后，腫瘤體積縮小、濕重降低，腫瘤組織中凋亡細(xì)胞增多，說(shuō)明腫瘤的生長(zhǎng)受到了抑制。本研究結(jié)果表明，抑制LHX3 的異常高表達(dá)可阻遏肝癌的發(fā)生、發(fā)展。

Hedgehog（Hh）是一種分泌性局域蛋白質(zhì)配體，其在腫瘤中被異常激活，參與腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。Shh 信號(hào)通路是Hh 通路的重要分支，在細(xì)胞增殖和分化中起著至關(guān)重要的作用，Shh 通路涉及胚胎發(fā)育、維護(hù)成熟器官內(nèi)環(huán)境和腫瘤發(fā)生等過(guò)程[13-16]。Shh 從細(xì)胞中輸出后能與跨膜蛋白Patched1（PTCH1）結(jié)合，促進(jìn)跨膜蛋白Smoothened（SMO）的活性，激活SMO 啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)，活化的SMO 從細(xì)胞質(zhì)隔離中釋放出與神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而導(dǎo)致Gli 在核內(nèi)定位，從而調(diào)節(jié)各種基因表達(dá)[17]。在本研究中，沉默LHX3 表達(dá)的肝癌細(xì)胞中Shh、Gli-l蛋白表達(dá)水平均下降，使用Shh 信號(hào)通路激動(dòng)劑Purmorphamine 處理細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力增強(qiáng)；在沉默LHX3 表達(dá)的肝癌移植瘤裸鼠模型的腫瘤組織中，Shh、Gli-l 蛋白表達(dá)水平也下降了。由此推測(cè)，LHX3 可能通過(guò)調(diào)控Shh信號(hào)通路參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，LHX3 在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，沉默該基因的表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，并可抑制裸鼠模型肝癌移植瘤的生長(zhǎng)，其機(jī)制可能與調(diào)控Shh 信號(hào)通路相關(guān)。本研究表明，LHX3 在肝癌組織中呈高表達(dá)，沉默LHX3 表達(dá)可抑制肝癌發(fā)生和發(fā)展，為肝癌的診治提供了理論依據(jù)。