吳秋萍 吳海豐 黃茂乙 周 云 周貴忠

慢加急性肝衰竭（ACLF）是指肝臟功能迅速惡化，同時(shí)伴隨一個(gè)或多個(gè)器官衰竭的臨床癥候群，患者的短期病死率較高[1]。在中國，多數(shù)ACLF 患者在慢性乙型肝炎（CHB）的基礎(chǔ)上發(fā)病[2]。ACLF 的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，多數(shù)患者病情嚴(yán)重，救治困難[3]。因此，早期診斷并了解患者的預(yù)后情況有助于提高生存率。目前雖已有多項(xiàng)生物標(biāo)志物被報(bào)道可判斷ACLF 患者的預(yù)后情況，但效能仍不能令人滿意，如部分標(biāo)志物的敏感度或特異度較低等[4]。miRNA 是一類由18～22 個(gè)核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，已被證實(shí)可參與ACLF 的發(fā)病和進(jìn)展過程，如miR-223[5]、miR-125b-5p[6]、miR-130a[7]和miR-124a[8]等。miR-708 已被報(bào)道可通過調(diào)控蛋白激酶B（Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路表達(dá)，抑制肝臟炎性反應(yīng)[9]。此外，miR-708 還可靶向Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路，抑制肝星狀細(xì)胞的活化和增殖[10]。研究表明，Akt/mTOR 信號通路和Wnt/β-catenin 信號通路均參與了ACLF 的發(fā)病和進(jìn)展過程[11-12]。由此推測，miR-708 可能通過調(diào)控上述通路的表達(dá)參與CHB 相關(guān)ACLF（CHB-ACLF）的發(fā)展過程，其水平或可反映患者的預(yù)后情況。目前，關(guān)于miR-708是否參與了ACLF 的發(fā)生、發(fā)展過程方面鮮有報(bào)道。本文探究了miR-708 與CHB-ACLF 患者預(yù)后生存情況的關(guān)系，以期尋找效能較高的指標(biāo)用以判斷患者的預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2018 年3 月至2020 年6 月在海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院就診的128 例CHB-ACLF 患者（設(shè)為CHB-ACLF 組）和100 例CHB 患者（設(shè)為CHB 組）作為研究對象。參照《慢性乙型肝炎防治指南（2015 更新版）》[13]診斷CHB，參照《肝衰竭診治指南（2012 年版）》[14]診斷ACLF。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）確診為CHB-ACLF 或CHB；（2）表現(xiàn)為凝血功能障礙[國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）＞1.5]、黃疸[總膽紅素（TBiL）＞85 μmol/L）]和低蛋白血癥；（3）近1 個(gè)月內(nèi)有腹水或并發(fā)肝性腦病。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴有嚴(yán)重的細(xì)菌感染或病毒感染；（2）伴有自身免疫性疾病，如炎癥性腸病、自身免疫性肝炎等；（3）伴有惡性腫瘤；（4）隨訪失聯(lián)。CHB-ACLF 組的年齡為31～67 歲，平均年齡為（48.52±7.86）歲；其中男性78 例，女性50 例。CHB 組的年齡為33～68 歲，平均年齡為（47.99±6.53）歲；其中男性65 例，女性35 例。兩組在年齡（t＝0.547，P＝0.585）和性別（χ2＝0.396，P＝0.529）方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批件號YL018003），納入的受試者均簽署了知情同意書。

1.2 臨床資料

收集所有受試者的年齡、性別、TBiL、INR、肌酐、終末期肝病模型（MELD）評分、血小板計(jì)數(shù)（PLT）和白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）等臨床資料。使用全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀檢測TBiL 和肌酐水平，使用Sysmex XN-3000 型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測PLT 和WBC，使用ACL-TOP 型全自動(dòng)凝血分析儀檢測INR。于CHB-ACLF 患者入院1 周后開始隨訪，采用電話隨訪或住院觀察的方式了解患者90 d 的生存情況，末次隨訪時(shí)間為2020 年9 月28 日，將隨訪過程中患者死亡定義為終點(diǎn)事件。

1.3 miR-708 水平檢測

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測各組患者血清miR-708 的表達(dá)水平[15]。所有患者于入院24 h 內(nèi)抽取肘部靜脈血10 mL，離心后獲取上層清液，置于-80 ℃環(huán)境中保存，待測。采用TRIzol 法提取血清中總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自日本TaKaRa公司）將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并使用PCR 儀（購自美國Bio-Rad 公司）擴(kuò)增cDNA，擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min，之后95 ℃ 30 s、59 ℃ 15 s、72 ℃ 20 s，共40 個(gè)循環(huán)。以U6 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-708 的相對表達(dá)量。引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列詳見表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用多因素logistic 回歸模型分析影響CHB-ACLF 患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。采用ROC 曲線評價(jià)miR-708 判斷CHB-ACLF 患者預(yù)后的效能。采用限制性立方樣條擬合logistic 回歸模型分析miR-708 與CHB-ACLF 患者預(yù)后的關(guān)系。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清miR-708 水平比較

CHB-ACLF 組的血清miR-708 相對表達(dá)量為0.43±0.16， 低 于CHB 組（0.75±0.14）， 兩 組 的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝16.422，P＜0.001）。CHBACLF 組入院后90 d 的生存率為51.56%（66/128）。根據(jù)CHB-ACLF 患者的預(yù)后生存情況將其分為生存組（n＝66）和死亡組（n＝62）。生存組的血清miR-708 相對表達(dá)量為0.52±0.14，高于死亡組（0.33±0.11），兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝8.713，P＜0.001）。

2.2 生存組和死亡組的基本資料比較

生存組和死亡組在年齡、性別方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。生存組的PLT 水平高于死亡組，而TBiL、INR、肌酐、WBC 和MELD評分均低于死亡組，兩組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表2。

表2 生存組和死亡組的基本資料比較

2.3 影響CHB-ACLF 患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

將CHB-ACLF 組入院90 d 的生存情況作為因變量，將PLT、TBiL、INR、肌酐、WBC、MELD評分和miR-708 作為自變量（均為原始值錄入），納入多因素logistic 回歸分析，結(jié)果顯示INR、肌酐和MELD 評分是CHB-ACLF 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），miR-708 是CHB-ACLF 患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素（P＜0.05）。見表3。

表3 CHB-ACLF 組預(yù)后的logistic 回歸分析

2.4 miR-708 與CHB-ACLF 患者預(yù)后生存的關(guān)系

miR-708 判斷CHB-ACLF 患者預(yù)后生存的ROC曲線下面積（AUC）、最佳截?cái)嘀?、敏感度和特異度?別 為0.864（95%CI：0.802～0.926）、0.39、79.03%和80.30%。MELD 評分判斷CHB-ACLF 患者預(yù)后生存的AUC、最佳截?cái)嘀?、敏感度和特異度分別為0.775（95%CI：0.693～0.857）、27 分、62.90% 和84.85%。結(jié)果表明miR-708 判斷CHB-ACLF 患者預(yù)后生存的AUC 大于MELD 評分，但兩者的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝1.680，P＝0.093），見圖1A。采用限制性立方樣條擬合多因素logistic 回歸模型分析miR-708 與CHB-ACLF 患者預(yù)后生存的關(guān)系，結(jié)果顯示當(dāng)節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)為3 時(shí)，AIC 值最?。ˋIC＝122.218），這提示miR-708 與CHB-ACLF 患者的預(yù)后生存有關(guān)（χ2＝32.20，P＜0.001），且呈線性關(guān)系（非 線 性 檢 驗(yàn)χ2＝1.07，P＝0.300）。以miR-708 判斷CHB-ACLF 患者預(yù)后生存的最佳截?cái)嘀底鳛榉纸琰c(diǎn)，當(dāng)miR-708＜0.39 時(shí)，CHB-ACLF 患者預(yù)后發(fā)生死亡的風(fēng)險(xiǎn)升高；當(dāng)miR-708＞0.39 時(shí)，CHBACLF 患者預(yù)后發(fā)生死亡的風(fēng)險(xiǎn)降低，見圖1B。

圖1 miR-708 與CHB-ACLF 患者預(yù)后生存的關(guān)系 A miR-708 和MELD 評分判斷CHB-ACLF 患者預(yù)后生存的ROC曲線 B miR-708 與CHB-ACLF 患者預(yù)后生存的限制性立方樣條圖

3 討論

目前已被應(yīng)用于ACLF 預(yù)后評估的生物標(biāo)志物主要包括與免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激相關(guān)的標(biāo)志物，以及基因組學(xué)標(biāo)志物等，但由于ACLF的誘因、發(fā)病機(jī)制、臨床干預(yù)措施等的多樣性及個(gè)體化差異，各項(xiàng)標(biāo)志物仍存在一定的局限性[16]。因此，探尋能夠準(zhǔn)確判斷ACLF 患者預(yù)后情況的生物標(biāo)志物具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，CHB-ACLF 組的血清miR-708 相對表達(dá)量低于CHB 組，這提示miR-708 可能參與了CHB 進(jìn)展為ACLF 的過程。本研究結(jié)果還顯示，CHB-ACLF 患者中生存組的血清miR-708 相對表達(dá)量高于死亡組，這提示miR-708 可能參與了ACLF 的發(fā)展過程，其水平或可反映患者的預(yù)后情況。為避免混雜因素影響分析結(jié)果，本研究將可能與CHB-ACLF 患者預(yù)后生存相關(guān)的因素納入多因素logistic 回歸模型，分析結(jié)果顯示miR-708 是CHB-ACLF 患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素。有研究表明，miR-708 不僅可靶向Akt/mTOR 信號通路抑制肝臟炎性反應(yīng)，還可靶向Wnt/β-catenin 信號通路抑制肝星狀細(xì)胞的活化和增殖[9-10]。此外，Akt/mTOR 信號通路與人肝星狀細(xì)胞內(nèi)炎性因子的表達(dá)有關(guān)[11]，Wnt/β-catenin 信號通路的藥理學(xué)刺激可抑制硫代乙酰胺誘導(dǎo)的急性肝衰竭進(jìn)程[12]。由此推測，miR-708 的表達(dá)水平與肝臟炎性反應(yīng)和纖維化程度密切相關(guān)，可反映CHB-ACLF 患者的預(yù)后情況。此外，本研究結(jié)果還顯示INR、肌酐和MELD 評分是CHB-ACLF 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這與已報(bào)道的研究結(jié)論相符[17-18]。

本研究構(gòu)建了miR-708 判斷CHB-ACLF 患者預(yù)后生存的ROC 曲線，結(jié)果顯示miR-708 判斷CHB-ACLF 患者預(yù)后生存的AUC、敏感度和特異度分別為0.864、79.03%和80.30%，其診斷效能優(yōu)于MELD 評分，可輔助用于CHB-ACLF 的預(yù)后判斷。此外，限制性立方樣條擬合多因素logistic 回歸分析結(jié)果顯示，miR-708 與CHB-ACLF 患者的預(yù)后呈線性關(guān)系，且低水平的miR-708 提示CHB-ACLF 患者預(yù)后發(fā)生死亡的風(fēng)險(xiǎn)增高。

綜上所述，檢測CHB-ACLF 患者血清miR-708的表達(dá)水平有助于判斷患者的預(yù)后生存情況。本研究尚存在不足之處，比如為單中心研究，納入的樣本量有限，尚不能完全排除地域、個(gè)體化差異等因素對分析結(jié)果的影響；且本研究未開展基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)分析miR-708 是否可通過靶向Akt/mTOR 和Wnt/β-catenin 信號通路參與CHB-ACLF 的進(jìn)展過程。今后課題組將針對以上不足之處，進(jìn)一步探究miR-708 影響CHB-ACLF 患者預(yù)后的病理、生理學(xué)機(jī)制。