丁 琴 李文文 劉 淵

IL-34 是集落刺激因子-1 受體（CSF-1R）的組織特異性配體，存在于包括魚類、兩棲動物、鳥類和哺乳動物等在內(nèi)的所有脊椎動物中，是一種新型細胞因子。IL-34 作為IL 家族中的一個新成員，在疾病診斷和治療中具有特殊的生理功能和重要的病理作用，并有廣闊的臨床應(yīng)用前景。研究發(fā)現(xiàn)，IL-34 與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病（IBD）和干燥綜合征等疾病的炎性反應(yīng)過程有關(guān)[1-2]。IL-34 在IBD 患者和實驗性結(jié)腸炎患者中高表達，并且其表達水平隨炎性反應(yīng)程度的加重而升高[3]。

在多細胞動物中，腸黏膜是宿主與共生菌群相互作用的主要場所。腸黏膜屏障是哺乳動物與腸道細菌共同進化形成的一種高度特異分化的黏膜。它由物理和化學(xué)成分構(gòu)成，可以滿足腸道對營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的需求，維持宿主與共生菌群和平共存，同時保護機體免受感染。由營養(yǎng)不良、感染或其他疾病引起的腸黏膜屏障功能紊亂，會導(dǎo)致腸黏膜通透性增高[4]。研究表明，腸黏膜通透性增高與多種消化系統(tǒng)疾病有關(guān)，如IBD、腸易激綜合征、腹腔疾病和早期結(jié)腸癌等[5]。

腸上皮作為防御腸道病原微生物的物理屏障，在黏膜免疫系統(tǒng)尤其是天然免疫中具有重要作用。天然免疫信號通路可維持組織和器官的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，如腸道微生物群、腸上皮細胞的增殖和凋亡及肝再生等[6-7]。腸上皮提供了一種選擇性的、可滲透的屏障，可以調(diào)控腸黏膜通透性，其作用主要是通過細胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)的。緊密連接蛋白復(fù)合物由跨膜蛋白和細胞內(nèi)支架蛋白組成，ZO-1 和Occludin 是主要的跨膜蛋白[8]。

本研究觀察了IL-34 基因敲除后小鼠腸黏膜通透性的變化情況，并探討了相關(guān)機制，以期進一步了解腸道的免疫調(diào)控機制，為探索腸黏膜屏障受損相關(guān)疾病的潛在治療靶點提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和細胞

選取20 只6 周齡、SPF 級、雄性的C57BL/6 野生型（WT）小鼠（購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司）作為研究對象。每籠5 只，飼養(yǎng)于南通大學(xué)實驗動物中心，室溫保持在21～23 ℃，濕度為50%～60%，12 h 光照和12 h 黑暗交替環(huán)境，自由進食、飲水。經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，采用隨機數(shù)表法將小鼠分為WT 組（WT 小鼠）和KO 組（IL-34-/-小鼠，由北京華夏凱奇公司設(shè)計并敲除），每組10 只。實驗期間每周測量和記錄兩組小鼠的體質(zhì)量。實驗過程中無小鼠死亡。Caco-2 細胞購自上海中國科學(xué)院細胞庫并保存于－80 ℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 腸道通透性測定 兩組小鼠均于第14 周稱重后禁食14 h，然后給予0.2 mL 異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖（FITC-dextran，60 mg/100 g）灌胃，灌胃后4 h，通過心臟穿刺取血0.8～1.0 mL[9]。采用FITC標記法檢測小鼠腸道通透性。取小鼠血樣在4 ℃下以3 000 r/min 離心5 min，獲取上層清液。用同體積PBS 溶液稀釋后，使用熒光分光光度計檢測熒光強度，激發(fā)波長為480 nm，發(fā)射波長為520 nm。1.2.2 組織病理學(xué)檢查 采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取出小鼠遠端結(jié)腸組織，使用預(yù)冷的PBS溶液反復(fù)沖洗以去除結(jié)腸組織表面殘留物（至少沖洗3 遍），快速將結(jié)腸組織置于4%多聚甲醛溶液中，常溫下固定。經(jīng)過水洗、常規(guī)脫水后石蠟包埋，4 μm 厚度切片，行H-E 染色，光鏡下觀察結(jié)腸黏膜的形態(tài)學(xué)改變。

1.2.3 實時熒光定量PCR 檢測 采用實時熒光定量PCR（real-time qPCR）法檢測小鼠結(jié)腸組織中ZO-1 和Occuldin 的表達水平。選取兩組小鼠的近端結(jié)腸樣品并保存于RNAlater 溶液中，4 ℃過夜，之后將樣品保存于－80 ℃冰箱。使用試劑盒抽提結(jié)腸組織RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 為模板進行擴增反應(yīng)，根據(jù)Genebank 中目的基因序列設(shè)計引物，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，序列見表1。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 s，之 后95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、81 ℃ 1 s，共45 個 循環(huán)。以β-actin 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算ZO-1和Occuldin 的相對表達量。除培養(yǎng)基，再加入含IL-34（100 ng/mL）的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。之后收集各組細胞。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測ZO-1 和Occuldin 的表達 收集細胞進行蛋白質(zhì)抽提，行SDS-PAGE 電泳，加入一抗、二抗孵育，1 h 后按照化學(xué)發(fā)光試劑盒使用說明書進行ECL 化學(xué)發(fā)光和曝光顯影，使用凝膠成像分析系統(tǒng)進行顯影和灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

表1 引物序列

1.2.4 免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)腸組織ZO-1 和Occuldin 的表達 將結(jié)腸組織的石蠟包埋標本切片，常規(guī)脫蠟，封閉液封閉10 min，滴加一抗，4 ℃過夜，滴加免疫組織化學(xué)檢測試劑盒內(nèi)的試劑Ⅲ，沖洗后再加試劑Ⅳ（按照試劑盒使用說明書進行操作），PBS 反復(fù)沖洗，用新鮮配制的DAB 液顯色，蘇木素復(fù)染。光鏡下觀察ZO-1 和Occuldin蛋白的染色情況。

1.2.5 Caco-2 細胞培養(yǎng) Caco-2 細胞用含20%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日倒置顯微鏡觀察細胞2 次，隔日更換1 次培養(yǎng)液，待細胞生長至80%密度時開始傳代。將Caco-2 細胞傳代后鋪6 孔板，饑餓處理16～18 h 后隨機分為3 組，其中正常對照組不進行處理；IL-34 組加入含IL-34（100 ng/mL）的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h；CSF-1R 抑制劑組先加入GW2580（100 ng/mL）預(yù)處理2 h 后，移

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用配對樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 敲除IL-34 基因?qū)π∈篌w質(zhì)量的影響

本研究通過連續(xù)14 周監(jiān)測KO 組和WT 組的體質(zhì)量變化情況，發(fā)現(xiàn)兩組的體質(zhì)量變化情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 兩組小鼠的體質(zhì)量變化

2.2 敲除IL-34 基因?qū)Y(jié)腸病理形態(tài)學(xué)的影響

H-E 染色結(jié)果顯示，WT 組和KO 組的結(jié)腸組織均無明顯損傷表現(xiàn)，腸黏膜上皮完整、連續(xù)，結(jié)腸腺體結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊，間質(zhì)分布均勻，無明顯炎性細胞浸潤、潰瘍、膠原纖維增生等。見圖2。

圖2 兩組小鼠結(jié)腸組織的病理圖像 H-E 染色 A WT 組 ×200 B WT 組 ×400 C KO 組 ×200 D KO組 ×400

2.3 敲除IL-34 基因?qū)π∈蠼Y(jié)腸黏膜通透性的影響

由圖3 所示，KO 組的血清FITC-dextran 水平明顯高于WT 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），這表明KO 組的結(jié)腸黏膜通透性較高。

2.4 敲除IL-34 基因?qū)π∈蠼Y(jié)腸ZO-1 和Occludin表達的影響

Real-time qPCR 檢測結(jié)果顯示，與WT 組比較，KO 組的結(jié)腸組織中ZO-1 mRNA 和OccludinmRNA的相對表達量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），見圖4。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，KO 組結(jié)腸組織中ZO-1 和Occludin 的表達水平均較WT 組顯著降低（P均＜0.05），見圖5。

圖3 兩組小鼠的血清FITC-dextran 表達水平

圖4 兩組小鼠結(jié)腸組織中ZO-1 mRNA 和OccludinmRNA 的相對表達量 A 兩組的ZO-1 mRNA 相對表達量 B 兩組的OccludinmRNA 相對表達量

圖5 兩組小鼠結(jié)腸組織中ZO-1 和Occludin 的表達水平 免疫組織化學(xué)染色 ×400 A WT 組的ZO-1 表達水平 B KO 組的ZO-1 表達水平 C WT 組的Occludin 表達水平 D KO 組的Occludin 表達水平

2.5 上 調(diào)IL-34 對Caco-2 細 胞ZO-1 和Occludin 表達的影響

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與正常對照組比較，IL-34 組Caco-2 細 胞ZO-1 和Occludin 的 表 達 水 平均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；CSF-1R 抑 制 劑 組Caco-2 細 胞ZO-1 和Occludin 的 表 達水平與正常對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。見圖6。

圖6 各組Caco-2 細胞中ZO-1 和Occludin 的表達 A 各組ZO-1 和Occludin 蛋白電泳圖 B 各組ZO-1 蛋白的表達水平 C 各組Occludin 蛋白的表達水平

3 討論

腸黏膜屏障是一個復(fù)雜的防御系統(tǒng)，由外部的“解剖學(xué)”物理屏障和內(nèi)部的“功能性”免疫屏障組成。物理屏障可阻止細菌黏附并調(diào)控其對宿主組織的擴散；免疫屏障則能夠區(qū)分共生菌與病原微生物，負責(zé)共生菌的免疫耐受及病原微生物的免疫反應(yīng)，兩者的相互作用可維持腸黏膜的通透性[10-11]。

腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整性對于維持正常的腸道通透性是非常必要的。一旦腸黏膜屏障被破壞，腸道通透性增高，使腸腔抗原易于通過屏障，導(dǎo)致腸黏膜發(fā)生炎性反應(yīng)及難以控制的免疫反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-34 基因敲除對小鼠的體質(zhì)量無明顯影響，與WT 組比較，KO 組結(jié)腸組織無明顯損傷表現(xiàn)，且無明顯炎性細胞浸潤。本研究利用FITCdextran 評價IL-34 基因敲除對小鼠腸黏膜通透性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KO 組血清FITC-dextran 水平明顯高于WT 組，這提示IL-34 基因敲除可增高腸黏膜通透性。

Caco-2 細胞系統(tǒng)是一種腸道體外模型，可用以評估化學(xué)物質(zhì)穿透腸黏膜屏障的能力，以及研究其轉(zhuǎn)運機制，利用Caco-2 細胞系統(tǒng)進行的藥物和化學(xué)物質(zhì)滲透性評價與其在人體內(nèi)的試驗數(shù)據(jù)有較理想的相關(guān)性[12]。緊密連接蛋白的表達或功能改變可能是腸黏膜通透性改變的機制[13]。緊密連接可使水、離子和溶質(zhì)通過孔隙來調(diào)節(jié)選擇性細胞旁通透性。緊密連接被破壞是造成腸黏膜屏障功能障礙和炎性反應(yīng)的主要原因。炎性反應(yīng)時緊密連接的變化可導(dǎo)致腸黏膜屏障功能異常，從而增高腸道通透性[14]。本研究評估了IL-34 基因敲除對ZO-1 和Occludin 表達的影響，結(jié)果顯示與WT組比較，KO 組結(jié)腸組織中ZO-1 mRNA 和OccludinmRNA 的相對表達量顯著降低；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，小鼠結(jié)腸組織中ZO-1 和Occludin 在IL-34缺乏時表達下調(diào)；此外，體外細胞實驗結(jié)果表明，IL-34 可上調(diào)Caco-2 細胞中ZO-1 和Occludin 的表 達。這些結(jié)果提示IL-34 可能通過調(diào)節(jié)ZO-1 和Occludin的表達而調(diào)控腸道通透性，進而改變腸黏膜屏障的功能。

CSF-1R 是一種Ⅲ型高親和力受體酪氨酸激酶，在髓系祖細胞中表達，可促進其發(fā)育、生存、增殖和正常功能，單核吞噬細胞主要依賴于CSF-1R 介導(dǎo)的信號通路[15]。研究顯示，IL-34 刺激人單核細胞中ERK1/2 磷酸化的作用被CSF-1R 的特異性抑制劑或中和抗體所阻斷，這表明CSF-1R 是IL-34的功能性受體[16]。IL-34 可在多種表達CSF-1R 的細胞中被觀察到相應(yīng)的信號通路激活，如髓系細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、神經(jīng)元和腫瘤細胞[17]。與IBD 合并結(jié)腸癌患者比較，CSF-1R基因在IBD 活動期或進展期患者中的表達水平較低[18]。IL-34 對CSF-1R 的刺激作用可導(dǎo)致人單核細胞中細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2 的磷酸化[17]。根據(jù)不同疾病背景及可能涉及的巨噬細胞亞群，抑制CSF-1R 活性可能具有抗炎或促炎作用[19]。本研究在體外細胞實驗中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CSF-1R抑制劑預(yù)處理及IL-34 刺激后，Caco-2 細胞中ZO-1和Occludin 的表達水平與正常對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這表明IL-34 可能通過結(jié)合CSF-1R 而調(diào)控ZO-1 和Occludin 的表達，從而調(diào)節(jié)腸黏膜屏障功能。由于IL-34 也可通過與硫酸軟骨素的低親和力相互作用與其他受體結(jié)合[20]，本研究是否涉及其他信號通路的調(diào)控需要進一步驗證。

綜上所述，IL-34 基因敲除后可能通過下調(diào)結(jié)腸組織中ZO-1 和Occludin 的表達，增高腸黏膜通透性，導(dǎo)致大量腸道來源的細菌及其產(chǎn)物移位，激活天然免疫系統(tǒng)，而過度活躍的天然免疫反應(yīng)可能會造成機體腸道微環(huán)境紊亂及腸上皮損傷，導(dǎo)致腸道局部炎性疾病的發(fā)生，甚至引發(fā)系統(tǒng)性疾病。因此，對于這類消化道疾病，調(diào)節(jié)腸黏膜屏障功能可能是一種新的治療和預(yù)防策略。