何 英 姜建春 李登云 黃 娟

克羅恩?。–D）是一種病因尚未明確的慢性炎性腸病，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、腹痛、腹瀉、腹部包塊及瘺管形成等，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量[1-2]。CD 患者的臨床表現(xiàn)差異較大，部分患者在臨床緩解后頻繁復(fù)發(fā)，對(duì)于該類患者應(yīng)及時(shí)救治，避免發(fā)生腸梗阻、腹腔膿腫等并發(fā)癥[3]。近年來隨著英夫利西單抗和阿達(dá)木單抗的臨床應(yīng)用，CD 的臨床緩解率已大幅升高，但仍有部分患者發(fā)生嚴(yán)重的并發(fā)癥，甚至需接受腸切除術(shù)治療[4]。因此，及早了解CD 患者的預(yù)后情況，及時(shí)采取針對(duì)性的干預(yù)措施，具有重要意義。

miRNA 是一類不具備編碼蛋白質(zhì)功能的單鏈RNA[5]。隨著基因診療技術(shù)的發(fā)展，多種miRNA 被證實(shí)參與了CD 的發(fā)病和進(jìn)展過程[6-8]。研究顯示，miR-27a 可通過調(diào)節(jié)Toll 樣受體4（TLR4）/NF-κB 信號(hào)通路抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞的遷移和侵襲[9]。此外，miR-27a 還可通過調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB 信號(hào)通路抑制IL-1β 誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎性反應(yīng)[10]。研究指出，TLR4/NF-κB 信號(hào)通路參與了CD 的發(fā)病及進(jìn)展過程[11]?；谏鲜鲅芯?，推測(cè)miR-27a 可能通過調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB 信號(hào)通路參與了CD 的病理、生理過程，其表達(dá)水平或可反映CD 患者的預(yù)后情況。本研究檢測(cè)了CD 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a的表達(dá)水平，并探究其與CD 患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016 年8 月至2017 年3 月在浙江衢化醫(yī)院就診的114 例CD 患者作為研究對(duì)象。參照《中國(guó)炎癥性腸病組織病理診斷共識(shí)意見》[12]診斷CD。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＜70 歲；（2）接受結(jié)直腸鏡檢查，確診為CD；（3）中、重度活動(dòng)期CD；（4）能夠配合完成研究所需檢查；（5）簽署了知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并惡性腫瘤；（2）近期接受過激素或免疫相關(guān)治療；（3）急性胃腸炎；（4）凝血功能異常；（5）合并心、腦血管疾??；（6）在前3 個(gè)月的隨訪期間發(fā)生CD 相關(guān)并發(fā)癥、腸黏膜異型增生或CD 相關(guān)死亡，以及接受腸切除術(shù)治療者；（7）CD 家族史。114 例CD 患者中男性64 例，女性50 例；年齡26～62 歲，平均年齡為（42.38±7.61）歲；中度活動(dòng)期78 例，重度活動(dòng)期36 例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 治療方案

參照《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見（2012年·廣州）》[13]治療CD 患者。所有患者均給予常規(guī)治療，包括糾正水、電解質(zhì)紊亂，營(yíng)養(yǎng)支持，保護(hù)腸黏膜及調(diào)節(jié)腸道菌群等。此外，根據(jù)患者的病情嚴(yán)重程度給予硫唑嘌呤（由上海信誼藥廠有限公司生產(chǎn)，每日1.5～4.0 mg/kg）或英夫利西單抗（由Cilag AG 公司生產(chǎn)，每次5.0 mg/kg）治療。

1.3 預(yù)后評(píng)估

采用復(fù)診和電話隨訪的方式了解CD 患者的預(yù)后情況。于患者出院后1 個(gè)月開始隨訪，為期3 年，每個(gè)月隨訪1 次，末次隨訪時(shí)間為2020 年3 月5 日。將CD 相關(guān)并發(fā)癥（如腸瘺、腸梗阻、復(fù)雜肛瘺、消化道大出血、腸穿孔及腹腔膿腫等）、接受腸切除術(shù)治療、腸黏膜異型增生或CD 相關(guān)死亡定義為預(yù)后不良[14]。

1.4 外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a 水平檢測(cè)

采用Ficoll 密度梯度離心法提取CD 患者外周血中的單個(gè)核細(xì)胞。分別于CD 患者治療前、治療2 周時(shí)和治療6 周時(shí)抽取空腹肘部靜脈血10 mL，室溫下以800 r/min（離心半徑為8 cm）離心15 min，取離心后下層沉淀物，將其置于10 mL Ficoll 分離液中，提取外周血中單個(gè)核細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a 的表達(dá)水平。在裝有單個(gè)核細(xì)胞的試管中加入TRIzol 試劑，提取總RNA，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA 的純度。取2 μg 總RNA 至反轉(zhuǎn)錄試劑盒中，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。使用PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，之后95 ℃變性15 s，60 ℃退火32 s，72 ℃延伸30 s，共計(jì)40 個(gè)循環(huán)。以β-actin 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法表示miR-27a 的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)治療前后比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。治療前、治療2 周時(shí)、治療6周時(shí)的外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a 水平的比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用ROC 曲線評(píng)估外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a 水平判斷CD 預(yù)后的效能。采用多因素logistic 回歸方法分析影響CD 預(yù)后的因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD 患者的預(yù)后情況

114 例CD 患者中有51 例（44.74%）預(yù)后不良，包括8 例（7.02%）腸瘺，9 例（7.89%）復(fù)雜性肛瘺，3 例（2.63%）消化道大出血，4 例（3.51%）腹腔膿腫，4 例（3.51%）腸梗阻，22 例（19.30%）接受腸切除術(shù)，1 例（0.88%）死亡。根據(jù)CD 患者的預(yù)后情況將其分為預(yù)后不良組（n＝51）和預(yù)后良好組（n＝63）。

2.2 兩組外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a 水平比較

由表2 可知，在治療2 周時(shí)和治療6 周時(shí)，預(yù)后良好組的miR-27a 水平均高于預(yù)后不良組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.001）；組內(nèi)比較結(jié)果顯示，兩組治療前、治療2 周時(shí)和治療6 周時(shí)的miR-27a 水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.001），兩組的miR-27a 水平隨治療時(shí)間延長(zhǎng)均呈升高趨勢(shì)，且預(yù)后良好組的miR-27a 水平升高幅度大于預(yù)后不良組（P＜0.05）。

表2 兩組miR-27a 的表達(dá)水平比較

2.3 miR-27a 判斷CD 患者預(yù)后的效能

由表3 可知，治療6 周時(shí)的外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a 水平判斷CD 患者預(yù)后的ROC 曲線下面積（AUC）大于治療前和治療2 周時(shí)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝5.893，P＜0.001；Z＝3.124，P＝0.002）。治療2 周時(shí)的miR-27a 水平判斷CD 患者預(yù)后的AUC 大于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝2.254，P＝0.024）。見圖1。

表3 miR-27a 判斷CD 患者預(yù)后的效能

圖1 miR-27a 判斷CD 預(yù)后的ROC 曲線

2.4 兩組的基本資料比較

兩組患者在性別、病變部位和吸煙史方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。預(yù)后不良組中確診年齡（A3 型）、疾病行為（穿透型）、肛周病變患者的占比均高于預(yù)后良好組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表4。

2.5 治療6 周時(shí)的miR-27a 水平與CD 患者臨床病理特征的關(guān)系

由表5 可知，CD 患者治療6 周時(shí)的miR-27a水平與確診年齡、性別、病變部位、疾病行為、吸煙史、肛周病變均無關(guān)（P均＞0.05）。

2.6 影響CD 患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

將CD 患者的預(yù)后情況作為因變量，將單因素分析中可能與CD 患者預(yù)后有關(guān)的項(xiàng)目[確診年齡（A3 型）、疾病行為（穿透型）、肛周病變和治療6 周時(shí)的miR-27a 水平]作為自變量，納入多因素logistic 回歸分析模型，結(jié)果顯示疾病行為（穿透型）、肛周病變是CD 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），治療6 周時(shí)的miR-27a 是CD 患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素（P＜0.05）。見表6。

表4 兩組的基本資料比較/例（%）

表5 不同臨床病理特征的CD 患者治療6 周時(shí)的miR-27a 水平比較

表6 影響CD 患者預(yù)后的多因素logistic 回歸分析

3 討論

TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的激活可上調(diào)炎性細(xì)胞因子水平，從而加重CD 患者腸黏膜的炎性反應(yīng)[15]。TLR4 對(duì)腸黏膜先天性免疫反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用，可參與調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡[16]。研究表明，miR-27a可通過調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB 信號(hào)通路，抑制脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的炎性反應(yīng)，加重腦缺血小鼠血腦屏障緊密連接損傷[17-18]。本文主要探究CD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a 的水平與預(yù)后的關(guān)系。

本研究的隨訪結(jié)果顯示，有44.74%的CD 患者預(yù)后不良，預(yù)后不良者的比例略高于郝曉煒等[6]的報(bào)道，其原因可能是本研究納入的CD 患者為中、重度活動(dòng)期。本研究通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)預(yù)后良好組和預(yù)后不良組外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a 的水平，發(fā)現(xiàn)隨治療時(shí)間延長(zhǎng)，兩組miR-27a 水平均呈升高趨勢(shì)；此外，與預(yù)后不良組比較，預(yù)后良好組治療2 周時(shí)、治療6 周時(shí)的miR-27a 水平均較高。上述結(jié)果提示治療后CD 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a 水平可能與預(yù)后有關(guān)。本研究進(jìn)一步構(gòu)建了治療前、治療2 周時(shí)、治療6 周時(shí)的miR-27a 水平判斷CD 預(yù)后的ROC 曲線，結(jié)果顯示治療6 周時(shí)的miR-27a 水平判斷CD 預(yù)后的AUC、敏感度和特異度分別為0.893、94.12%和74.60%，該結(jié)果提示治療6 周時(shí)的miR-27a 水平判斷CD 預(yù)后的效能較高，但特異度較低，可輔助評(píng)估CD 預(yù)后。

黃超群等[19]的研究表明，CD 的疾病行為（狹窄型、穿透型）、肛周病變是其預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究采用多因素logistic 回歸法分析了影響CD患者預(yù)后的相關(guān)因素，結(jié)果顯示疾病行為（穿透型）、肛周病變是CD 預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與上述研究結(jié)果相符。此外，本研究結(jié)果還指出，治療6 周時(shí)的miR-27a 水平是CD 預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素。

綜上所述，CD 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a 的表達(dá)水平較低，且其表達(dá)水平越低，提示患者發(fā)生預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)越高。治療6 周時(shí)的外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a 的水平判斷CD 的預(yù)后具有較高價(jià)值。今后本課題組將進(jìn)一步開展基礎(chǔ)研究，驗(yàn)證miR-27a 是否通過抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路降低炎性細(xì)胞因子水平，從而減輕CD 患者腸黏膜的炎性反應(yīng)。