盧金蘭 王麗麗 盧 哲

肝細(xì)胞癌（HCC）是一種富血供的惡性腫瘤，90%以上的血供來自于肝動(dòng)脈[1]。經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化學(xué)治療栓塞術(shù)（TACE）可有效阻斷腫瘤的血供，并將化學(xué)治療藥物集中靶向腫瘤病灶，已成為治療HCC 常用的非手術(shù)方法之一。研究報(bào)道，HCC 在中國的發(fā)病率較高，約占全球HCC 新發(fā)病例總數(shù)的55%[2]。近年來，隨著腫瘤治療技術(shù)的發(fā)展，HCC 的病死率顯著降低[3]。研究發(fā)現(xiàn)，給予相同腫瘤分期的HCC 患者TACE 治療后存在預(yù)后差異較大的情況[4]，因此，探究能夠準(zhǔn)確評(píng)估TACE 治療預(yù)后的生物標(biāo)志物具有重要意義。

沉默信息調(diào)節(jié)因子7（SIRT7）是去乙?；窼irtuins 家族中的一員，已被報(bào)道可通過靶向p53依賴性細(xì)胞死亡途徑調(diào)控HCC 細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感度[5]，并可調(diào)節(jié)HCC 細(xì)胞的生長、增殖及腫瘤免疫微環(huán)境等[6-8]。因上述機(jī)制均與TACE 治療的臨床獲益關(guān)系密切，由此推測(cè)SIRT7 的表達(dá)水平可能與經(jīng)TACE 治療的HCC 患者預(yù)后有關(guān)。本文檢測(cè)了經(jīng)TACE 治療的HCC 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中SIRT7 的表達(dá)水平，并分析其與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選擇2016 年6 月至2018 年3 月在武警北京市總隊(duì)醫(yī)院就診的104 例HCC 患者作為研究對(duì)象。參照《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2011 年版）》[9]診斷HCC。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）首次確診并接受TACE治療；（2）Child-Pugh 分級(jí)為A 級(jí)或B 級(jí)；（3）預(yù)計(jì)生存期＞3 個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）HCC 分期為Ⅲb 期或Ⅳ期；（2）對(duì)碘對(duì)比劑過敏；（3）存在TACE 治療禁忌證，如肝腎功能嚴(yán)重障礙、無法糾正的凝血功能嚴(yán)重減退等；（4）年齡＞80 歲；（5）接受過射頻消融或微波消融治療。所有入組患者均簽署了知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 TACE 治療方案

所有入組患者在TACE 治療前均進(jìn)行血常規(guī)、尿常規(guī)、凝血功能、肝腎功能及心電圖等常規(guī)檢查，收集患者的年齡、性別、Child-Pugh 分級(jí)、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、甲胎蛋白（AFP）、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)量、腫瘤分期及治療方案等信息。采用Seldinger 技術(shù)經(jīng)股動(dòng)脈穿刺插管至腹腔動(dòng)脈，行血管造影，明確HCC 的供血?jiǎng)用}。通過CT 或MRI 檢查明確是否存在肝外供血?jiǎng)用}。經(jīng)肝動(dòng)脈灌注化學(xué)治療藥物奧沙利鉑（100 mg/m2）和5-氟尿嘧啶（500 mg/m2），并注入已充分乳化的阿霉素（40 mg/m2），然后與超液化碘油混懸液栓塞，最后用明膠海綿顆粒栓塞，栓塞終點(diǎn)為栓塞血管呈“干樹枝”狀。根據(jù)HCC 的大小及血供情況決定乳化劑用量，最大程度做到完全栓塞。TACE 治療后常規(guī)給予保肝、止吐、營養(yǎng)支持及鎮(zhèn)痛等治療，密切觀察有無并發(fā)癥發(fā)生。醫(yī)囑患者在TACE 治療后4 周復(fù)診，觀察碘油沉積、HCC 組織壞死及有無新的HCC 病灶等情況[10]。

1.3 SIRT7 表達(dá)水平檢測(cè)

采用Ficoll 密度梯度離心法提取外周血中的單個(gè)核細(xì)胞。抽取HCC 患者TACE 治療前和治療后（首次治療后7 d）的空腹肘部靜脈血10 mL，PBS溶液稀釋，置于Ficoll 分離液中低溫離心、分離；PBS 溶液重懸，再次離心，重復(fù)2 次，吸取單個(gè)核細(xì)胞。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞中SIRT7的表達(dá)水平[11]。步驟如下：（1）使用含蛋白抑制劑的RIPA 溶液裂解單個(gè)核細(xì)胞，離心，提取總蛋白；（2）使用BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量；（3）在80 V 電壓下凝膠電泳15 min，然后電壓升至120 V，直至溴酚藍(lán)跑出膠面；（4）緩沖液漂洗，轉(zhuǎn)膜；（5）5%脫脂奶粉封閉2 h，滴加一抗（購自武漢菲恩生物科技有限公司），4 ℃環(huán)境下孵育過夜；（6）緩沖液漂洗，滴加二抗（購自武漢菲恩生物科技有限公司），室溫下孵育2 h；（7）曝光顯影，應(yīng)用ImageJ 1.8.0 軟件讀取實(shí)驗(yàn)圖像。

1.4 隨訪

采用電話和復(fù)診方式了解患者的預(yù)后生存情況。在HCC 患者出院后4 周采用復(fù)診方式進(jìn)行首次隨訪，之后每3 個(gè)月隨訪1 次，為期36 個(gè)月，末次隨訪時(shí)間為2021 年3 月2 日，以患者死亡作為隨訪終點(diǎn)事件。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示。采用重復(fù)測(cè)量方差分析法比較生存組和死亡組治療前后SIRT7 的表達(dá)水平。采用ROC 曲線評(píng)估SIRT7 判斷經(jīng)TACE 治療的HCC 患者預(yù)后的效能。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，用logrank 檢驗(yàn)比較生存曲線的差異。采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對(duì)經(jīng)TACE 治療的HCC 患者的預(yù)后影響因素進(jìn)行單因素和多因素分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC 患者的臨床特征

104 例HCC 患 者 中 男 性68 例，女 性36 例；年齡48～70 歲，平均年齡為（62.11±4.56）歲；Child-Pugh 分級(jí)為A 級(jí)有78 例，B 級(jí)有26 例；腫瘤分期為Ⅰb 期有9 例，Ⅱ期有44 例，Ⅲa 期有51 例；HBsAg 陽性有86 例，陰性有18 例；AFP＞400 g/L有61例，≤400 g/L有43例；腫瘤直徑＞5 cm有50例，直徑≤5 cm 有54 例；腫瘤單發(fā)有40 例，多發(fā)有64 例；伴血管侵犯有51 例；接受1 次TACE 治療者有68 例，而≥2 次者有36 例；后續(xù)接受索拉非尼治療有11 例，接受利卡汀治療有13 例。

2.2 兩組的SIRT7 相對(duì)表達(dá)水平比較

與治療前比較，生存組和死亡組治療后SIRT7的表達(dá)水平均較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。與死亡組比較，生存組治療前和治療后SIRT7 的表達(dá)水平均較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見圖1、圖2。

圖1 兩組SIRT7 的蛋白質(zhì)印跡圖

圖2 兩組SIRT7 的相對(duì)表達(dá)量

2.3 SIRT7 判斷經(jīng)TACE 治療的HCC 患者預(yù)后的效能

治療前SIRT7 水平判斷經(jīng)TACE 治療的HCC患者預(yù)后生存的ROC 曲線下面積（AUC）、最佳截?cái)嘀?、敏感度和特異度分別為0.750（95%CI：0.648～0.853）、1.85、63.64% 和83.10%；治 療 后SIRT7 水平判斷HCC 患者預(yù)后生存的AUC、最佳截?cái)嘀?、敏感度和特異度分別為0.894（95%CI：0.828～0.959）、1.23、75.76%和88.73%；治療前后SIRT7 水平差值判斷HCC 患者預(yù)后生存的AUC、最佳截?cái)嘀?、敏感度和特異度分別為0.567（95%CI：0.444～0.691）、0.60、48.48%和70.42%。以上結(jié)果顯示，治療后SIRT7 水平判斷HCC 患者預(yù)后的AUC大于治療前SIRT7 及治療前后SIRT7 水平的差值，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝2.299，P＝0.022；Z＝5.645，P＜0.001）。見圖3。

2.4 SIRT7 的表達(dá)水平與經(jīng)TACE 治療的HCC 患者預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)104 例HCC 患者SIRT7 的相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)（1.15），將患者分為SIRT7 高表達(dá)組（n＝48）和SIRT7 低表達(dá)組（n＝56）。SIRT7 高表達(dá)組的中位生存時(shí)間為25 個(gè)月，短于SIRT7 低表達(dá)組（36 個(gè) 月），差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（log-rankχ2＝18.261，P＜0.001）。見圖4。

圖3 SIRT7 判斷經(jīng)TACE 治療的HCC 患者預(yù)后的ROC曲線

2.5 影響經(jīng)TACE 治療的HCC 患者預(yù)后生存的相關(guān)因素

將104 例HCC 患者的預(yù)后生存情況作為因變量，將患者年齡、性別、Child-Pugh 分級(jí)、腫瘤分期、HBsAg、AFP、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)量、TACE 治療次數(shù)、索拉非尼、利卡汀和治療后SIRT7 水平作為自變量，納入Cox 單因素回歸分析，結(jié)果顯示腫瘤分期、腫瘤直徑、索拉非尼、利卡汀和治療后SIRT7 水平與經(jīng)TACE 治療的HCC 患者預(yù)后生存有關(guān)（P＜0.05）。將104 例HCC 患者的預(yù)后生存情況作為因變量，將單因素分析中P＜0.10 的項(xiàng)目，包括Child-Pugh 分級(jí)、腫瘤分期、腫瘤直徑、索拉非尼、利卡汀和治療后SIRT7 水平作為自變量，納入Cox 多因素回歸分析，結(jié)果顯示腫瘤分期、腫瘤直徑和治療后SIRT7 是經(jīng)TACE 治療的HCC 患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），索拉非尼和利卡汀是其獨(dú)立保護(hù)因素（P＜0.05）。見表1。

圖4 SIRT7 高表達(dá)組和低表達(dá)組的生存曲線

表1 影響經(jīng)TACE 治療的HCC 患者預(yù)后生存的單因素和多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

3 討論

SIRT7 是唯一存在于細(xì)胞核中的Sir2 家族成員，是RNA 聚合酶Ⅰ轉(zhuǎn)錄的激活因子[12]，參與了肝臟脂質(zhì)代謝、線粒體穩(wěn)態(tài)、染色體結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄功能調(diào)節(jié)等過程[13-15]。另有研究顯示，SIRT7 參與了HCC、胃癌等的發(fā)生和發(fā)展過程[5-8,16]。本文主要探討了經(jīng)TACE 治療的HCC 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中SIRT7 的表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，生存組和死亡組治療后SIRT7 的表達(dá)水平均低于治療前，且生存組治療前后SIRT7 的表達(dá)水平均低于死亡組，這提示外周血單個(gè)核細(xì)胞中SIRT7 的表達(dá)水平與HCC 患者的預(yù)后生存情況可能有關(guān)。本研究進(jìn)一步構(gòu)建了SIRT7預(yù)測(cè)HCC 患者預(yù)后生存的ROC 曲線，結(jié)果顯示治療后SIRT7 水平判斷經(jīng)TACE 治療的HCC 患者預(yù)后生存的AUC 大于治療前SIRT7 水平和治療前后SIRT7 水平的差值，這提示治療后SIRT7 水平可輔助評(píng)估經(jīng)TACE 治療的HCC 患者的預(yù)后情況。

本研究結(jié)果顯示，SIRT7 高表達(dá)組的中位生存時(shí)間短于SIRT7 低表達(dá)組，這提示SIRT7 的表達(dá)水平與HCC 患者的預(yù)后有關(guān)。本研究指出，治療后SIRT7 水平是經(jīng)TACE 治療的HCC 患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，推測(cè)其原因可能是SIRT7 可參與調(diào)控HCC 細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物的敏感度，并可調(diào)節(jié)HCC 細(xì)胞的生長、增殖及腫瘤免疫微環(huán)境等[5-8]，進(jìn)而可反映患者的預(yù)后情況。此外，本研究結(jié)果還顯示腫瘤分期和腫瘤直徑是HCC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，索拉非尼和利卡汀是其獨(dú)立保護(hù)因素，這與既往報(bào)道結(jié)果相符[17-19]。

綜上所述，經(jīng)TACE 治療的HCC 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中SIRT7 的表達(dá)水平與患者預(yù)后生存情況有關(guān)。本研究僅檢測(cè)了HCC 患者治療前及首次接受TACE 治療后7 d 的外周血單個(gè)核細(xì)胞中SIRT7 的表達(dá)水平，尚不能確定判斷HCC 患者預(yù)后的SIRT7 的最佳檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，下一步將增設(shè)SIRT7 的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，以彌補(bǔ)本研究的不足。此外，今后還需開展大樣本、前瞻性研究以驗(yàn)證本研究的結(jié)論。