施春晶 呂俊衍 張 丹 文 玉 羅粟風 普光宇 李明珂 陳 杭 馬嵐青

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是一種與胰島素抵抗、肥胖和代謝綜合征密切相關的代謝性疾病，目前已成為全球范圍內(nèi)慢性肝病的常見病因，全球患病率約為25%且呈升高及低齡化趨勢[1-2]。NAFLD 已逐漸成為肝細胞癌和終末期肝病的主要病因，預測其將成為肝移植的常見適應證[3]。隨著生活方式的改變和肥胖的流行，中國的NAFLD 患病率亦逐年升高，每年新發(fā)病例約占4%[4]。因此，對NAFLD 預防和治療的研究顯得十分重要。

同型半胱氨酸（Hcy)是一種非必需α-氨基酸，是蛋氨酸甲基化反應生成的重要中間產(chǎn)物。肝臟能分解代謝飲食中的大部分蛋氨酸，85%的Hcy轉硫作用在肝臟進行，因此肝臟是Hcy 的重要代謝器官，Hcy 代謝異?？蓪е赂咄桶腚装彼嵫Y（HHcy）[5]。葉酸是由蝶啶、對氨基苯甲酸及谷氨酸殘基組成的一種水溶性B 族維生素，機體自身不能合成，需通過外源性補充。飲食中的葉酸經(jīng)二氫葉酸還原酶先轉化為二氫葉酸，然后轉化為四氫葉酸（THFA），再通過維生素B6、維生素B12和甜菜堿共同作用的一系列酶反應轉化為5-甲基四氫葉酸（5-MTHF），作為甲基供體參與蛋氨酸循環(huán)[6]。維生素B12主要通過飲食獲取，其是甲基化過程中的重要輔助因子，參與蛋氨酸、胸腺嘧啶等的合成[7]。葉酸和維生素B12是Hcy 代謝途徑所必需的輔助因子，可影響血清Hcy 水平。研究顯示NAFLD 患者的血清Hcy 水平通常顯著升高，HHcy可能是NAFLD 發(fā)病的危險因素[8]。目前HHcy 誘發(fā)NAFLD 的機制尚未明確，亦無特異性檢查方法和有效藥物用于NAFLD 的早期診斷和治療。本研究探究了NAFLD 患者的血清Hcy、葉酸和維生素B12水平的變化及其臨床意義，以期為NAFLD 的預防和治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017 年5 月至2018 年12 月在昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院體檢中心接受無創(chuàng)肝纖維化診斷系統(tǒng)FibroTouch 檢查的199 名體檢者作為研究對象。納入標準：（1）無飲酒史，或男性每周攝入乙醇＜140 g、女性每周攝入乙醇＜70 g）；（2）入組前1 年內(nèi)未曾服用葉酸、B 族維生素、茶堿，以及激素、甲氨蝶呤、四環(huán)素、他莫昔芬、抗結核藥物等可影響血清Hcy 水平和導致肝脂肪變性的藥物；（3）無病毒性肝炎、藥物性肝炎、自身免疫性肝病、肝豆狀核變性、糖原貯積病等導致NAFLD 的疾??；（4）無嚴重心、腦、肺、腎等器官疾病和嚴重神經(jīng)、精神疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準[（2021）倫審L 第4 號]，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 收集臨床資料 收集受試者的年齡、身高、體質(zhì)量、腹圍資料。計算體質(zhì)指數(shù)（BMI）：BMI＝體質(zhì)量（kg）/身高（m）2。

1.2.2 血清學指標檢測 受試者于抽血前一晚開始禁食、禁飲12 h，于次日清晨抽取4 mL 空腹肘靜脈血，采用循環(huán)酶法檢測血清Hcy 水平（正常值范圍5～15 μmol/L），免疫化學發(fā)光法測定血清葉酸（正常值范圍5.38～20 ng/mL）、維生素B12水平（正常值范圍211～911 pg/mL）。1.2.3 肝臟FibroTouch 檢查 使用FibroTouch 儀器及配套設施（購自無錫海斯凱爾醫(yī)學技術有限公司）對受試者肝臟行脂肪衰減參數(shù)（FAP）和肝臟硬度（LSM）測定，由具有操作資格證書的醫(yī)生參照FibroTouch 用戶手冊[9]定人定機完成。測量時患者取仰臥位，右手置于腦后，身體略向左側彎曲以最大限度擴展肋間隙，選擇右側腋前線至腋中線第7 至第9 肋間隙為檢測區(qū)域，保持探頭與體表垂直，避開血管、囊腫、結節(jié)等可能干擾檢測準確率的部位。每例受試者至少進行10 次有效測量，取有效測量結果的中位數(shù)為最終結果（檢測偏差值≤中位數(shù)的33%且成功率≥60%為有效測量）。1.2.4 分組標準 參照FibroTouch 用戶使用手冊[9]，采用FAP 值評價肝臟脂肪變程度：FAP≤240 dB/m為 正 常；240 dB/m＜FAP≤265 dB/m 為 輕 度；265 dB/m＜FAP≤295 dB/m 為中度；FAP＞295 dB/m為重度。依據(jù)《瞬時彈性成像技術診斷肝纖維化專 家 共 識（2018 年 更 新 版）》[10]和METAVIR 纖維化評分系統(tǒng)[11]，采用LSM 值評價NAFLD 組的肝纖維化程度：LSM＜6 Kpa 為F0 級；6 Kpa≤LSM＜7 kPa 為F1 級；7 kPa≤LSM＜7.9 kPa 為F2 級；7.9 kPa≤LSM＜10.3 kPa 為F3 級；LSM≥10.3 kPa 為F4級。本研究根據(jù)FAP 值將受試者分為健康對照組（55例）和NAFLD 組（144 例），再將NAFLD 組分為輕度、中度和重度肝脂肪變性組（39 例、46 例、59 例），根據(jù)LSM 值分為NAFLD 非肝纖維化組（F0 級70 例）和NAFLD 合并肝纖維化組（F1 級及以上74 例）。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)應用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，相關性分析采用Pearson 直線相關分析，NAFLD 危險因素分析采用多因素logistic 回歸分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NAFLD 組與健康對照組的一般資料比較

與健康對照組相比，NAFLD 組的腰圍明顯增加，BMI 和血清Hcy 水平明顯升高，血清維生素B12水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。兩組男女比例的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。兩組年齡和血清葉酸水平的差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 NAFLD 組與健康對照組的觀察指標比較

2.2 輕度、中度和重度肝脂肪變性組的血清學指標比較

3 組的血清Hcy、葉酸和維生素B12水平差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），提示血清Hcy、葉酸和維生素B12均不能作為NAFLD 患者肝脂肪變性嚴重程度的評價指標。見表2。

2.3 NAFLD 非肝纖維化組與NAFLD 合并肝纖維化組的血清學指標比較

兩組的血清Hcy、葉酸和維生素B12水平差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），提示血清Hcy、葉酸和維生素B12均不能作為NAFLD 是否合并肝纖維化的評價指標。見表3。

2.4 NAFLD 及NAFLD 合并肝纖維化的危險因素分析

分別對NAFLD 組與健康對照組、NAFLD 非纖維化組與NAFLD 合并肝纖維化組的數(shù)據(jù)進行多因素Logistic 回歸分析, 以是否診斷為NAFLD、NAFLD 是否合并肝纖維化為應變量, 將變量血清Hcy、葉酸和維生素B12水平納入方程進行分析，結果顯示血清Hcy 和維生素B12為NAFLD 的危險因素（P均＜0.05），而血清葉酸不是NAFLD 的危險因素（P＞0.05），血清Hcy、葉酸和維生素B12均不是NAFLD 合并肝纖維化的危險因素（P均＞0.05）。見表4。

表2 輕度、中度和重度肝脂肪變性組的血清學指標比較（x±s）

表3 NAFLD 非肝纖維化組與NAFLD 合并肝纖維化組的血清學指標比較（x±s）

表4 NAFLD 及NAFLD 合并肝纖維化的危險因素的logistic 回歸分析

2.5 血清Hcy 水平與血清葉酸、維生素B12水平的相關性分析

Pearson 直線相關分析顯示，健康對照組的血清Hcy 水平與血清葉酸、維生素B12水平無明顯相關性，NAFLD 組的血清Hcy 水平與血清葉酸、維生素B12水平呈直線負相關。見圖1。

圖1 NAFLD 組的血清Hcy 與血清葉酸、維生素B12的相關性分析 A 血清Hcy 水平與血清葉酸水平 B 血清Hcy水平與血清維生素B12水平

3 討論

NAFLD 是一種存在個體差異性的代謝性疾病，其病因、發(fā)病機制和自然轉歸方面均具有高度異質(zhì)性。NAFLD 的發(fā)生受飲食、遺傳、腸道微生物變化、合并疾病和代謝狀態(tài)等多種因素相互作用的影響[12]。攝入的食物及其代謝產(chǎn)物與NALFD 的發(fā)生密切相關，調(diào)整飲食等非藥物干預方法可能可以作為NAFLD 防治的重要措施[13]。

國內(nèi)外研究顯示，血清Hcy 水平在NAFLD 患者中普遍升高，HHcy 可能是NAFLD 發(fā)生、發(fā)展的獨立危險因素[14-15]。血清Hcy 水平升高可導致肝組織炎性細胞浸潤，可誘導氧化應激反應，造成肝細胞損傷，血清Hcy 水平與肝纖維化及肝細胞損傷的嚴重程度密切相關[16]。此外，血清Hcy水平升高還可誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激上調(diào)膽固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白（SREBP）的表達，增加膽固醇合成及活化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），進而激活脂肪酸氧化并抑制脂肪酸合成，使肝臟內(nèi)脂肪過量沉積而發(fā)生肝脂肪變性，從而引發(fā)NAFLD[17]。上述研究提示，血清Hcy 水平與NAFLD 密切相關，血清Hcy 水平升高可能可以作為NAFLD 發(fā)生、發(fā)展的預測指標。本研究結果也顯示，NAFLD 患者的血清Hcy 水平較健康人群明顯升高，其可能在NAFLD 的發(fā)病中起著一定的作用。

Hcy 在機體的主要代謝方式是通過葉酸依賴途徑重新甲基化生成蛋氨酸，或通過胱硫醚-β-合成酶轉化為胱硫氨酸[18]。Hcy 再甲基化過程中，5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）在維生素B12參與下催化5，10-亞甲基四氫葉酸鹽（5，10-MTHF）還原為5-MTHF，蛋氨酸合成酶（MS）以維生素B12為輔助因子，5-MTHF 提供甲基供體催化Hcy 再甲基化，使甲基從5-MTHF 轉移到Hcy中，形成新的蛋氨酸，用于蛋白質(zhì)合成或轉化為S-腺苷同型半胱氨酸（SAH），SAH 可通過SAH 水解酶可逆地轉化為Hcy[19]。由此可見，葉酸是重要的甲基供體，維生素B12是甲基轉移酶的重要輔助因子，血清Hcy 與血清葉酸、維生素B12之間呈負相關。本研究結果也顯示，NAFLD 患者的血清Hcy 水平與血清葉酸、維生素B12水平呈直線負相關。體內(nèi)血清Hcy 水平主要受遺傳和飲食等因素影響，遺傳因素是MTHFR 基因突變導致酶活性降低，飲食因素是膳食中缺乏葉酸和維生素B12[20]。當葉酸和維生素B12缺乏或利用障礙時可阻礙Hcy再甲基化途徑，導致血清Hcy 水平升高進而參與NAFLD 的發(fā)生。Dai 等[17]的研究顯示NAFLD 患者的血清Hcy 水平升高，伴有血清葉酸和維生素B12水平降低，HHcy 是導致NAFLD 的獨立危險因素。本研究結果顯示，與健康對照組相比，NAFLD 組的血清Hcy 水平升高，血清維生素B12水平降低，兩者是NAFLD 的危險因素，這與上述研究相符。外源性補充葉酸、維生素B12可使Hcy 再甲基化重新合成蛋氨酸，從而降低血清Hcy 水平，這可能可以減輕肝細胞損傷，抑制肝細胞的脂質(zhì)合成，緩解肝脂肪變性。

研究表明，Hcy 與心腦血管疾病、2 型糖尿病等多種疾病有關，HHcy 已被證明是冠心病、原發(fā)性高血壓的獨立危險因素，葉酸聯(lián)合維生素B12治療可有效降低慢性心血管疾病合并HHcy 患者的血清Hcy 水平，減少心血管不良事件的發(fā)生[21]。NAFLD 是一種多系統(tǒng)疾病，可影響肝外多器官的代謝調(diào)節(jié)，增高2 型糖尿病、心血管疾病的發(fā)生風險[22]。高血清Hcy 水平可促進血管平滑肌細胞增殖，可誘導血管內(nèi)皮功能障礙及炎性細胞因子產(chǎn)生從而誘發(fā)炎性反應，并可促進血小板聚集和抑制纖溶作用導致微血栓形成，這些機制均有助于動脈粥樣硬化斑塊形成，共同促進了心血管不良事件的發(fā)生[23-24]，故HHcy 可能是預防NAFLD 并發(fā)心血管不良事件的有效靶點。

有研究表明血清葉酸和維生素B12水平與NAFLD 的嚴重程度密切相關[25-26]。Mahamid 等[27]的研究顯示低血清葉酸和維生素B12水平與較高的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）組織病理學分級顯著相關。Bertol 等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，高血清維生素B12水平與肝脂肪變性及纖維化的嚴重程度呈正相關。然而，本研究結果顯示血清Hcy、葉酸和維生素B12均不能作為NAFLD 患者肝脂肪變性嚴重程度及是否合并肝纖維化的評價指標，與上述研究結論不符，推測原因可能是：（1）NAFLD 的發(fā)生、發(fā)展受多種因素的共同影響，NAFLD 患者可能會改變飲食習慣，導致血清Hcy、葉酸和維生素B12水平發(fā)生了變化；（2）目前NAFLD 的發(fā)病機制尚未完全明確，尚無臨床指南推薦或限制相關維生素的攝入以預防NAFLD；（3）本研究結果可能存在偏倚，今后可進行前瞻性研究來驗證。此外，本研究還顯示NAFLD 組與健康對照組的男女比例存在差異（P＜0.001），NAFLD 組的男性占比高于女性。Della Torre[29-30]的研究也顯示男性患NAFLD 的風險較女性高，這可能與雌激素水平、免疫反應和肝臟代謝的性別特異性調(diào)節(jié)等因素相關。

綜上所述，本研究顯示NAFLD 患者的血清Hcy 水平高于健康人群，血清維生素B12水平低于健康人群，臨床上對NAFLD 患者進行血清Hcy、葉酸和維生素B12水平的監(jiān)測具有重要臨床意義。外源性補充葉酸和維生素B12可有效降低血清Hcy水平，這可能成為NAFLD 防治的新策略。個體化補充葉酸和維生素B12是否能有效降低NAFLD 合并HHcy 患者的血清Hcy 水平，進而抑制NAFLD進展，有待進一步的臨床研究。