沈羿廷，黎可華，張 融

(1.株洲市中心醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，湖南 株洲 412000；2.長(zhǎng)沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院 內(nèi)科學(xué)教研室，湖南 長(zhǎng)沙 410000)

慢性鼻-鼻竇炎是鼻腔鼻竇的慢性炎癥性疾病[1]。慢性鼻-鼻竇炎鼻腔、鼻竇解剖結(jié)構(gòu)異常、變態(tài)反應(yīng)和感染為主要致病因素,從而導(dǎo)致嗅覺(jué)減退、膿涕、鼻塞等為主要癥狀的疾病[2]。慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉是慢性鼻-鼻竇炎的一個(gè)亞型,是耳鼻咽喉頭頸外科難治性疾病之一,多次手術(shù)治療效果并不滿意,較容易復(fù)發(fā)[3]。該病的發(fā)病較為復(fù)雜,受多種因素的影響,本質(zhì)上是發(fā)生在鼻腔和鼻竇粘膜的免疫炎癥反應(yīng),包括變應(yīng)性因素、細(xì)菌生物膜、鼻腔鼻竇解剖異常、細(xì)菌感染、真菌感染、細(xì)菌超抗原以及纖毛系統(tǒng)功能異常等[4]。微小RNA是目前研究的熱點(diǎn),是一類(lèi)大小為22個(gè)核苷酸左右的單鏈非編碼RNA,廣泛存在動(dòng)植物和病毒的生物體內(nèi),調(diào)控影響著生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程[5]。let-7是最早發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)miRNA,參與基因調(diào)控、個(gè)體發(fā)育和細(xì)胞黏附等功能活動(dòng)[6]。相關(guān)研究報(bào)道,let-7家族中l(wèi)et-7g在肝癌中低表達(dá),與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)[7]。本研究通過(guò)let-7g介導(dǎo)的缺氧誘導(dǎo)慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉成纖維細(xì)胞,對(duì)該細(xì)胞增殖作用的影響,為臨床治療慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉提供有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年11月至2021年3月入本院耳鼻咽喉頭頸外科行鼻內(nèi)鏡手術(shù)治療慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉患者10例,患者年齡18～64歲,男6例,女4例。術(shù)中所取的鼻息肉組織經(jīng)過(guò)PBS緩沖液沖洗,并去除膿性分泌物、黏液以及壞死組織,放入EP管中,浸入冰水。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合2018年中國(guó)慢性鼻竇炎診斷和治療指南;②術(shù)后病理學(xué)證實(shí)為慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉的診斷; ③入組患者近1個(gè)月內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素、抗生素、抗組胺類(lèi)藥物以及免疫抑制劑治療;④收集標(biāo)本前經(jīng)過(guò)患者以及家屬同意。排除標(biāo)準(zhǔn):①霉菌性鼻竇炎、鼻竇腫瘤等患者;②自身免疫性疾病及免疫缺陷性疾病的患者。

1.2 主要試劑 Let-7g mimic由上海生工生物有限公司合成;PBS緩沖液、胰蛋白酶購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自上海威奧生物科技有限公司;多聚甲醛、Prime Script TMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、VEGF和IL-19一抗購(gòu)自碧云天生物科技有限公司;鏈霉素青霉素雙抗購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 組織細(xì)胞分離 將EP管中的鼻息肉標(biāo)本放到無(wú)菌的培養(yǎng)皿中,PBS沖洗,采用組織剪剪成0.5～1 mm,再用PBS沖洗,靜置一段時(shí)間后去上清液,轉(zhuǎn)入到新的EP管中,加入dispaseⅡ酶1 mL,孵育過(guò)夜,移除液體,在剩余的組織中加入0.25%的胰蛋白酶、0.02%的EDTA后,置于37°C水浴箱中,20 min中取出,吹打消化后組織,100目過(guò)濾,離心處理,棄上清,PBS清洗,再次吹打。在將分離后的組織分別放置在培養(yǎng)皿中,加入5 mL的培養(yǎng)液,分別放于常氧和低氧條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),常氧是以普通空氣作為氣體進(jìn)行培養(yǎng),低氧是利用氮?dú)膺M(jìn)行培養(yǎng),控制氧體積分?jǐn)?shù),24 h可見(jiàn)組織塊周?chē)屑?xì)胞向外生長(zhǎng),2 d更換1次培養(yǎng)液,7 d后組織塊周?chē)罎M細(xì)胞,10 d后細(xì)胞相互匯合。繼續(xù)傳代培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度為80%左右時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng),適量胰蛋白酶消化,吹打分散細(xì)胞,分裝稀釋細(xì)胞,在進(jìn)行細(xì)胞凍存與復(fù)蘇,分裝入培養(yǎng)皿內(nèi),將培養(yǎng)皿放入 37°C 5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)48 h后,換液繼續(xù)培養(yǎng),對(duì)人鼻息肉成纖維細(xì)胞細(xì)胞進(jìn)行鑒定,傳代至第4～7代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 CCK-8法檢測(cè)人鼻息肉成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)情況 分別取出常氧和低氧下培養(yǎng)的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人鼻息肉成纖維細(xì)胞接種于96孔板中,接種的細(xì)胞密度為5×104/孔,在37°C 5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育,24 h更換液體1次,采用CCK-8試劑酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上檢測(cè),在450 nm波長(zhǎng)測(cè)定96孔的吸光度OD值,連續(xù)測(cè)定7 d,并記錄1～10 d的細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組 將人鼻息肉成纖維細(xì)胞分成4組,常氧組、低氧組、let-7g空白組、let-7g模擬組,常氧組為常規(guī)普通空氣作為氣體進(jìn)行培養(yǎng)的人鼻息肉成纖維細(xì)胞,低氧組為氮?dú)膺M(jìn)行培養(yǎng)的人鼻息肉成纖維細(xì)胞,let-7g空白組是將miR-NC轉(zhuǎn)染到人鼻息肉成纖維細(xì)胞中,在低氧環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng),let-7g模擬組是將Let-7g mimic轉(zhuǎn)染到人鼻息肉成纖維細(xì)胞中,在低氧環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。采用CCK-8法檢測(cè)0、24、48、72 h的各組的細(xì)胞增殖情況,方法同上。

1.3.4 qRT-PCR檢測(cè)let-7g的表達(dá) 分別將常氧培養(yǎng)、低氧培養(yǎng)、常氧組、低氧組、let-7g空白組、let-7g模擬組的人鼻息肉成纖維細(xì)胞,采用TRIzol提取總RNA,使用Prime Script TMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA,將cDNA稀釋處理,取2 μL樣品,按照qRT-PCR試劑盒使用說(shuō)明檢測(cè),let-7g mRNA上游5′-TCAGCAAACACAACTCCTCCT-3-3′,下游5′-TCAAAGGTCACAACTCCATCC-3′;GAPDH作為內(nèi)參,異物序列為上游5′-TGGCCTCCAAGGAGTAAGAAAC-3′,下游5′-GGCCTCTCTCTTGCTCTCAGTATC-3′,PCR循環(huán)條件:95°C初始孵育30 s,95°C變性5 s,60°C退火31 s,40個(gè)循環(huán),用相對(duì)定量2-ΔΔCT法計(jì)算組織中l(wèi)et-7g mRNA的水平,GAPDH作為miRNA的內(nèi)源性對(duì)照。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人鼻息肉成纖維細(xì)胞的凋亡情況 收集各組已經(jīng)處理過(guò)的細(xì)胞,采用胰酶消化,置于流式管內(nèi),6°C下孵育,PBS洗滌3次,再將細(xì)胞密度調(diào)整為1.0×106個(gè)/mL,離心處理后,加入500 μL結(jié)合液重懸細(xì)胞,再加入5 μL的 Annexin V-FITC著色液慢慢混勻,按照Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,室溫孵育14 min,加入500 μL binding buffer重懸細(xì)胞,加入PI著色液,避光靜止5 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.6 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VEGF和IL-19蛋白的表達(dá) 收集各組已經(jīng)處理過(guò)的細(xì)胞,PBS清洗后加入RIPA裂解液,采用BCA 法檢測(cè)蛋白的濃度,按照試劑盒的使用標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作,采用SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)到PVDF膜,在室溫條件下使用5%的脫脂奶粉封閉1 h,加入VEGF一抗(1∶100)和IL-19一抗(1∶500),4°C孵育過(guò)夜,進(jìn)行TBST清洗,室溫下在加入二抗(1∶5 000)孵育1 h,TBST洗膜,以GAPDH作為內(nèi)參,ECL法顯影,采用Image J 軟件分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1 人鼻息肉成纖維細(xì)胞鑒定 經(jīng)過(guò)初步形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn),人鼻息肉成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)星形、梭形、紡錘形等不規(guī)則形態(tài),細(xì)胞中有卵圓形的細(xì)胞核,核仁比較明顯,胞質(zhì)外伸,會(huì)有3～6個(gè)長(zhǎng)短不齊的突起,單個(gè)或者多個(gè)細(xì)胞之間相互粘連聚集(見(jiàn)圖1)。

A:人鼻息肉成纖維細(xì)胞(×100);B:人鼻息肉成纖維細(xì)胞(×200)。圖1 倒置顯微鏡下觀察人鼻息肉成纖維細(xì)胞

2.2 常氧和低氧條件下人鼻息肉成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)情況對(duì)比 CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,1～6 d,常氧狀態(tài)下的人鼻息肉成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)率與低氧狀態(tài)下對(duì)比無(wú)明顯差異(P>0.05),7～10 d,常氧狀態(tài)下的人鼻息肉成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)率顯著低于低氧狀態(tài),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖2)。

圖2 常氧和低氧條件下人鼻息肉成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線比較

2.3 let-7g在常氧和低氧環(huán)境下人鼻息肉成纖維細(xì)胞中的表達(dá) 低氧環(huán)境下let-7g的水平顯著低于常氧環(huán)境下的水平(P<0.05);在不同時(shí)間內(nèi),0 h和2 h中的let-7g的水平對(duì)比無(wú)明顯差異(P>0.05),但4、8、12、24 h中l(wèi)et-7g的水平顯著低于0 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖3)。

*：與常氧比較, P<0.05； *、**：分別與低氧環(huán)境下0 d比較, P<0.05, P<0.05。圖3 let-7g在不同環(huán)境下人鼻息肉成纖維細(xì)胞中的表達(dá)

2.4 let-7g對(duì)低氧誘導(dǎo)的人鼻息肉成纖維細(xì)胞增殖的影響 0～24 h,各組人鼻息肉成纖維細(xì)胞增殖能力對(duì)比無(wú)明顯差異(P>0.05),48～96 h,低氧組、let-7g空白組、let-7g模擬組人鼻息肉成纖維細(xì)胞增殖能力明顯高于常氧組(P<0.05),let-7g空白組的人鼻息肉成纖維細(xì)胞增殖能力與低氧組對(duì)比無(wú)明顯差異(P>0.05),let-7g模擬組人鼻息肉成纖維細(xì)胞增殖能力明顯低于低氧組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖4)。

*：與常氧組比較, P<0.05；#：與低氧組比較, P<0.05。圖4 let-7g對(duì)低氧誘導(dǎo)的人鼻息肉成纖維細(xì)胞增殖的影響

2.5 let-7g對(duì)低氧誘導(dǎo)的人鼻息肉成纖維細(xì)胞凋亡的影響 低氧組、let-7g空白組、let-7g模擬組人鼻息肉成纖維細(xì)胞凋亡率明顯低于常氧組(P<0.05),let-7g空白組的人鼻息肉成纖維細(xì)胞凋亡率與低氧組對(duì)比無(wú)明顯差異(P>0.05),let-7g模擬組人鼻息肉成纖維細(xì)胞凋亡率明顯高于低氧組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖5)。

*：與常氧組比較, P<0.05;#：與低氧組比較, P<0.05。 圖5 let-7g對(duì)低氧誘導(dǎo)的人鼻息肉成纖維細(xì)胞凋亡的影響

2.6 let-7g對(duì)低氧誘導(dǎo)的人鼻息肉成纖維細(xì)胞中VEGF和IL-19蛋白的影響 低氧組、let-7g空白組、let-7g模擬組人鼻息肉成纖維細(xì)胞中VEGF和IL-19蛋白明顯高于常氧組(P<0.05),let-7g空白組的人鼻息肉成纖維細(xì)胞中VEGF和IL-19蛋白與低氧組對(duì)比無(wú)明顯差異(P>0.05),let-7g模擬組人鼻息肉成纖維細(xì)胞中VEGF和IL-19蛋白明顯低于低氧組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖6)。

圖6 let-7g對(duì)低氧誘導(dǎo)的人鼻息肉成纖維細(xì)胞VEGF和IL-19的影響

3 討論

慢性鼻-鼻竇炎是耳鼻喉科常見(jiàn)的一種慢性炎癥疾病。在中國(guó)的發(fā)病率高達(dá)8%,歐美地區(qū)的發(fā)病率為11%,南韓低于占比約為8.4%[8],不僅嚴(yán)重影響著患者的生存質(zhì)量,同時(shí)給社會(huì)帶來(lái)了一定的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。該病包括慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉和慢性鼻-鼻竇炎不伴鼻息肉兩種[9]。其中慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉臨床癥狀較重,尚未出現(xiàn)較為有效的藥物,以手術(shù)治療為主,術(shù)后復(fù)發(fā)率較高,預(yù)后較差,所以探討其發(fā)病機(jī)制是目前耳鼻喉科研究的熱點(diǎn)。慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉是多因素疾病,具有高度的異質(zhì)性,所用的治療效果都不盡人意。盡管關(guān)于該病已經(jīng)出現(xiàn)了大量的報(bào)道,但關(guān)于其發(fā)病機(jī)制和病因目前尚不清楚。miRNA是一個(gè)長(zhǎng)度為18-24nt的小分子RNA,廣泛存在于各種生物中,轉(zhuǎn)錄后調(diào)控著各種基因的表達(dá)[10]。相關(guān)研究表明,在伴有鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎組中會(huì)有7種miRNAs表達(dá)上調(diào),69種miRNAs表達(dá)下調(diào),這就說(shuō)明慢性鼻-鼻竇炎可能與miRNA機(jī)制相關(guān)蛋白的變化異常有一定的關(guān)系,參與了炎癥發(fā)生發(fā)展[11]。

miRNA let-7屬于細(xì)胞分化的標(biāo)志物,在人類(lèi)中不僅起著促進(jìn)分化的作用,而且在成體組織中高表達(dá),在干細(xì)胞中低表達(dá)[12]。近期研究表明,let-7表達(dá)的降低與腫瘤的致瘤性增加和患者預(yù)后具有一定的相關(guān)性[13]。let-7家族被認(rèn)為是一種腫瘤抑制miRNA,尤其是let-7g,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)let-7g通過(guò)靶基因調(diào)控著炎癥反應(yīng)和低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖等[14]。目前關(guān)于let-7g在鼻-鼻竇炎伴鼻息肉中的相關(guān)報(bào)道較少,所以本研究探討let-7g在低氧誘導(dǎo)慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉成纖維細(xì)胞中的表達(dá),并探討其對(duì)細(xì)胞調(diào)控的作用。本研究結(jié)果首先對(duì)鼻息肉組織細(xì)胞進(jìn)行分離,分別放于常氧和低氧條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧狀態(tài)下形成的人鼻息肉成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)率明顯高于常氧狀態(tài)。同時(shí)采用qRT-PCR檢測(cè)let-7g在低氧中的表達(dá),結(jié)果顯示,低氧環(huán)境下let-7g水平顯著低于常氧環(huán)境下的水平,而且隨著在低氧中的時(shí)間越長(zhǎng),let-7g水平的表達(dá)越低。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA let-7在慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉中的作用機(jī)制,采用CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)證明let-7g對(duì)人鼻息肉成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的作用,結(jié)果顯示,低氧組、let-7g空白組、let-7g模擬組人鼻息肉成纖維細(xì)胞增殖能力明顯高于常氧組,let-7g模擬組人鼻息肉成纖維細(xì)胞增殖能力明顯低于低氧組;低氧組、let-7g空白組、let-7g模擬組人鼻息肉成纖維細(xì)胞凋亡率明顯低于常氧組,let-7g模擬組人鼻息肉成纖維細(xì)胞凋亡率明顯高于低氧組、所以說(shuō)明過(guò)表達(dá)let-7g可阻斷缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡。

VEGF促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的因子,參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展,包括癌癥、炎癥疾病和癌癥等[15]。IL-19屬于IL-20的亞家族,主要作用為調(diào)節(jié)機(jī)體Thl和Th2平衡,促使機(jī)體體液免疫反應(yīng)發(fā)生發(fā)展[16]。在不同生理狀況下可以表現(xiàn)為雙重免疫效應(yīng),促炎或者抗炎。本研究采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VEGF和IL-19蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示,低氧組、let-7g空白組、let-7g模擬組人鼻息肉成纖維細(xì)胞中VEGF和IL-19蛋白明顯高于常氧組,let-7g模擬組人鼻息肉成纖維細(xì)胞中VEGF和IL-19蛋白明顯低于低氧組。說(shuō)明過(guò)表達(dá)let-7g可以抑制中VEGF和IL-19表達(dá)。相關(guān)研究表明,低氧和炎癥因子聯(lián)合作用增加了VEGF的產(chǎn)生,可能參與了鼻竇炎的發(fā)病機(jī)制[17]。已有研究表明,IL-19在慢性鼻-鼻竇炎發(fā)展的過(guò)程中起到了一定的促炎作用[18]。

綜上所述,過(guò)表達(dá)let-7g可阻斷缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡,有效的降低VEGF和炎癥因子水平。