石海波，李 冬，嚴(yán)丹麗

(四川省資陽(yáng)市第一人民醫(yī)院 腫瘤科，四川 資陽(yáng) 641300)

肝癌的發(fā)病率與死亡率逐年上升，手術(shù)、化療等治療手段可提高肝癌患者的生存率，但化療等治療方法的毒副作用較大[1-2]。隨著對(duì)中藥抗腫瘤的研究，越來(lái)越多的研究表明中藥的活性成分具有抗肝癌的作用[3-4]。白及為蘭科白及屬多年生草本植物，多糖是其主要活性成分，研究表明白及多糖具有抗肝癌作用，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未闡明[5]。環(huán)狀RNA(Circular RNA，circRNA)具有穩(wěn)定性與組織特異性，其在腫瘤中表達(dá)異常并可參與多種疾病發(fā)生發(fā)展過程，研究表明circ_0006168在食管癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲[6]。Circular RNA Interactome預(yù)測(cè)顯示circ_0006168與miR-127-5p存在結(jié)合位點(diǎn)。研究表明miR-127-5p在肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平降低，上調(diào)其表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖及侵襲[7]。因此，本研究主要探討白及多糖是否可通過調(diào)控circ_0006168/miR-127-5p分子軸而調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 白及莖塊購(gòu)自亳州市徽永堂生物科技有限公司；人肝癌細(xì)胞HCC9204購(gòu)自美國(guó)ATCC；DMEM培養(yǎng)液與胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Trizol試劑、Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；cDNA合成及qRT-PCR試劑購(gòu)自北京天根生化公司；miR-NC、miR-127-5p mimics、si-NC、si-circ_0006168、pcDNA、pcDNA-circ_0006168購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；CCK-8試劑、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；雙熒光素酶報(bào)告基因載體及其活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 白及多糖的提取[8]白及莖塊中加入20倍體積的蒸餾水，60℃回流提取4 h后再重復(fù)1次，收集2次提取液后過濾，10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min后提取上清液，加入石油醚后充分混勻，吸取下層提取液后加入2%活性炭，40℃水浴30 min后過濾并經(jīng)70℃減壓濃縮，加入無(wú)水乙醇沉淀后經(jīng)10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，提取沉淀后加入蒸餾水，采用Savage法脫蛋白，直至無(wú)中間層析出，相同條件下離心后吸取上清液，采用流水透析3 d后經(jīng)蒸餾水透析2 d，真空冷凍干燥后得到白及多糖，加入培養(yǎng)基稀釋液至50、100、200 μg/mL。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 HCC9204細(xì)胞接種于6孔板(1×104個(gè)/孔)，加入含有不同濃度(0、50、200 μg/mL)白及多糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別記為白及多糖0、50、100、200 μg/mL組。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將si-NC、si-circ_0006168分別轉(zhuǎn)染至HCC9204細(xì)胞，分別記為si-NC組、si-circ_0006168組。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pcDNA、pcDNA-circ_0006168分別轉(zhuǎn)染至HCC9204細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后加入含有濃度為200 μg/mL白及多糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別記為白及多糖+pcDNA組、白及多糖+pcDNA-circ_0006168組。

1.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集各組HCC9204細(xì)胞接種于96孔板(3×103個(gè)/孔)，每孔加入CCK-8溶液10 μL，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h后應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm波長(zhǎng)處的光密度值(OD值)并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率[(對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%]。

1.2.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 取各組HCC9204細(xì)胞接種于6孔板(500個(gè)/孔)，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 d，棄培養(yǎng)基，加入預(yù)冷PBS洗滌后加入甲醇500 μL固定20 min，棄甲醇后加入1%結(jié)晶紫染色液400 μL染色15 min，蒸餾水洗滌后晾干并置于顯微鏡下統(tǒng)計(jì)細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 取各組HCC9204細(xì)胞(1×105個(gè)/mL)分別接種于小室的上室(200 μL/孔)，下室加入600 μL含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色液染色10 min，于顯微鏡下統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 用胰蛋白酶消化各組CAL-27細(xì)胞(5×105個(gè)/mL)，取1 mL細(xì)胞懸液經(jīng)3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞沉淀后加入400 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入5 μL Annexin V-FITC與5 μL PI，室溫避光孵育15 min，于1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 qRT-PCR檢測(cè)circ_0006168、miR-127-5p的表達(dá)水平 取各組HCC9204細(xì)胞加入1 mL Trizol試劑后室溫孵育5 min，3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，分別加入氯仿、異丙醇后離心，棄上清，加入75%乙醇1 mL洗滌RNA沉淀，離心后棄上清得到RNA。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，應(yīng)用羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量。circ_0006168正向引物5′-ACCAGCAGAACTAGGAAACA-3′，反向引物5′-TGGCATCCCTATTAGTCTTTC-3′；GAPDH正向引物5′-GGGAAGCTCACTGGCATGGCCTTCC-3′，反向引物5′-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3′；miR-127-5p正向引物5′-TTCCCACCTGCGGGGTG-3′，反向引物5′-TCTAGAGAAATCTTTGAATGCCAAG-3′；U6正向引物5′-TCCGATCGTGAAGCGTTC-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circ_0006168與miR-127-5p的靶向關(guān)系 采用用分子克隆法將circ_0006168與miR-127-5p的結(jié)合位點(diǎn)克隆至pGL3質(zhì)粒中構(gòu)建野生型載體WT-circ_0006168，采用點(diǎn)突變?cè)噭┖袑⒔Y(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，然后將突變位點(diǎn)克隆至pGL3質(zhì)粒中構(gòu)建突變型載體MUT-circ_0006168，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將WT-circ_0006168、MUT-circ_0006168分別與miR-NC或miR-127-5p mimics共轉(zhuǎn)染至HCC9204細(xì)胞，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞并采用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 白及多糖對(duì)HCC9204增殖、凋亡、遷移的影響 與白及多糖0 μg/mL組比較，50、100、200 μg/mL組細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，克隆形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)，且呈劑量依賴性(見圖1、表1)。

圖1 不同濃度白及多糖誘導(dǎo)HCC9204凋亡

表1 白及多糖抑制HCC9204增殖、遷移及誘導(dǎo)凋亡

2.2 白及多糖對(duì)HCC9204中circ_0006168和miR-127-5p表達(dá)的影響 與白及多糖0 μg/mL組比較，50、100、200 μg/mL組circ_0006168的表達(dá)量降低(P<0.05)，miR-127-5p的表達(dá)量升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性(見表2)。

表2 白及多糖對(duì)circ_0006168和miR-127-5p表達(dá)的檢測(cè)

2.3 circ_0006168和miR-127-5p靶向關(guān)系 circ_0006168與miR-127-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖2。miR-127-5p過表達(dá)可抑制野生型載體WT-circ_0006168的熒光素酶活性(P<0.05)，見表3。

圖2 circ_0006168和miR-127-5p互補(bǔ)序列

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.4 下調(diào)circ_0006168對(duì)HCC9204增殖、凋亡、遷移的影響 與si-NC組比較，si-circ_0006168組miR-127-5p的表達(dá)量升高(P<0.05)，細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率升高(P<0.05)，克隆形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)，見圖3、表4。

圖3 下調(diào)circ_0006168誘導(dǎo)HCC9204凋亡

表4 下調(diào)circ_0006168抑制HCC9204增殖、遷移及誘導(dǎo)凋亡

2.5 circ_0006168對(duì)白及多糖處理的HCC9204增殖、凋亡、遷移的影響 與白及多糖+pcDNA組比較，白及多糖+pcDNA-circ_0006168組miR-127-5p的表達(dá)量降低(P<0.05)，細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率降低(P<0.05)，克隆形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)，見圖4、表5。

圖4 circ_0006168可逆轉(zhuǎn)白及多糖對(duì)HCC9204凋亡的誘導(dǎo)作用

表5 circ_0006168對(duì)白及多糖處理的HCC9204增殖、凋亡、遷移的作用

3 討論

中草藥的活性成分具有抗腫瘤作用，研究表明中草藥可通過調(diào)控多個(gè)靶點(diǎn)基因表達(dá)而發(fā)揮抗肝癌作用[9-10]。circRNA在肝癌中表達(dá)異常，并可充當(dāng)miRNA的海綿體而調(diào)節(jié)其靶基因表達(dá)從而參與肝癌發(fā)生發(fā)展過程，還可能作為肝癌治療的潛在靶點(diǎn)[11]。但circRNA是否可作為中草藥治療肝癌的潛在靶點(diǎn)尚未闡明。

白及多糖具有抗結(jié)腸癌[12]、胃癌[13]的作用，并可抑制腫瘤生長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示，隨著白及多糖濃度的增加，肝癌細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率升高，克隆形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)減少，提示白及多糖可抑制肝癌細(xì)胞增殖、克隆形成及遷移，并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。分析原因可能在于白及多糖具有抗腫瘤作用，其可能通過抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移從而發(fā)揮抗肝癌作用。

為進(jìn)一步探究白及多糖抗肝癌的作用機(jī)制，本研究結(jié)果顯示，白及多糖能夠以濃度依賴性的方式降低circ_0006168的表達(dá)量，而增高miR-127-5p的表達(dá)量，提示白及多糖可能通過抑制circ_0006168表達(dá)而促進(jìn)miR-127-5p的表達(dá)從而發(fā)揮抗肝癌作用。研究表明circ_0006168在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，并可促進(jìn)細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[14]。circ_0006168在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并可通過調(diào)節(jié)miR-516b-5p/XBP1分子軸的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲[15]。miR-127-5p在胃癌細(xì)胞中表達(dá)水平降低，上調(diào)其表達(dá)可通過靶向調(diào)控SORT1的表達(dá)而抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[16]。miR-127-5p高表達(dá)可抑制食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)展進(jìn)程[17]。本研究初步證實(shí)circ_0006168可靶向結(jié)合miR-127-5p，并可充當(dāng)miR-127-5p的海綿分子。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)circ_0006168表達(dá)可減弱白及多糖對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移的抑制作用及其對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。提示白及多糖可通過調(diào)控circ_0006168/miR-127-5p的表達(dá)而發(fā)揮抗肝癌作用。

綜上所述，白及多糖可通過抑制circ_0006168表達(dá)而促進(jìn)miR-127-5p表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖、克隆形成及遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，circ_0006168/miR-127-5p分子軸在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中可發(fā)揮重要調(diào)控作用，可作為白及多糖治療肝癌的潛在靶點(diǎn)，還可為肝癌治療提供新方向。但白及多糖是否可通過調(diào)控其他基因或信號(hào)通路表達(dá)而發(fā)揮抗腫瘤作用仍需進(jìn)一步探究。