焦麗萍，吳遠(yuǎn)慧，楊曉靜

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 皮膚科，河北 張家口 075000)

皮膚老化是皮膚喪失結(jié)構(gòu)完整性和正常生理功能的過程，該過程可能由內(nèi)在因素或外在因素引起[1]。來自日光中的紫外線(UV)輻射是引起皮膚衰老的主要外在因素，UV分為長波紫外線UVA(320～400 nm)、中波紫外線UVB(280～320 nm)和短波紫外線UVC(100～280 nm)3種波長范圍。UVC幾乎完全被臭氧層所吸收，因此，到達(dá)地球表面的紫外線主要由大約90% UVA和10% UVB組成，UVA和UVB均可直接破壞DNA分子或誘導(dǎo)相鄰嘧啶堿基之間的嘧啶二聚體形成，從而導(dǎo)致突變發(fā)生[2-3]。UVB不能有效穿透表皮，主要造成曬傷，而UVA則可以到達(dá)真皮層，在皮膚損害和老化中起主要作用[4]。

人皮膚成纖維細(xì)胞(Human skin fibroblasts,HSF)是皮膚衰老過程中的主要受損細(xì)胞之一，其主要存在于皮膚的真皮層中，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)成分。在經(jīng)過紫外線照射后，HSF細(xì)胞的增殖、分化以及合成分泌功能均會發(fā)生明顯的改變[5-6]。本研究利用UVA輻射HSF細(xì)胞建立光損傷皮膚模型，通過siRNA-Caveolin-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSF細(xì)胞，探討靶向抑制Caveolin-1對UVA誘導(dǎo)的HSF細(xì)胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人皮膚成纖維細(xì)胞HSF(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；p38MAPK抑制劑SB203580(美國Santa Cruz)；胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素及 DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco)；LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒(美國Invitrogen)；Trizol試劑、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTMII試劑盒(日本Takara)；MTT 試劑、DCFH-DA活性氧檢測試劑盒、SA-β-GAL 染色試劑盒(北京索萊寶)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海貝博)；PVDF膜、Bradford蛋白濃度測定試劑盒、ECL 超敏發(fā)光液(上海碧云天)；抗體Caveolin-1、p16、p21、p38 MAPK、P-p38 MAPK、p53(英國Abcam)；GAPDH、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋)；本研究引物序列合成均由上海生工生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人皮膚成纖維細(xì)胞HSF復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基孵育，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞生長鋪滿瓶底80%時，使用含0.02% EDTA 的胰蛋白酶進(jìn)行消化，離心后更換為完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與處理 待HSF細(xì)胞生長至對數(shù)期時，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/mL，取100 μL接種于96孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)的HSF細(xì)胞隨機(jī)分為4組：①Control組，為正常培養(yǎng)的HSF細(xì)胞；②siRNA-Cav-1組，為轉(zhuǎn)染siRNA-Caveolin-1質(zhì)粒的HSF細(xì)胞；③UVA組，經(jīng)20 J/cm2UVA照射48 h的HSF細(xì)胞；④siRNA-Cav-1+UVA組，轉(zhuǎn)染 siRNA-Caveolin-1質(zhì)粒，再經(jīng)20 J/cm2UVA照射48 h的HSF細(xì)胞。按脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒步驟進(jìn)行HSF細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作，每組均重復(fù)3次。此外，在進(jìn)行p16、p21、p38 MAPK、P-p38 MAPK及 p53蛋白表達(dá)檢測時，設(shè)置分組包括Control組、SB203580組(10 μmol/L SB203580處理48 h)、UVA組(20 J/cm2UVA照射48 h)、SB203580+UVA組(10 μmol/L SB203580處理48 h，再經(jīng)20 J/cm2UVA照射48 h)、siRNA-Cav-1+UVA組(轉(zhuǎn)染 siRNA-Caveolin-1質(zhì)粒，再經(jīng)20 J/cm2UVA照射48 h)。

1.2.3 實(shí)時熒光定量 PCRTrizol法提取各處理組HSF細(xì)胞總RNA。通過PrimeScript RT reagent Kit with gDNAEraser試劑盒對總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以獲得cDNA，并參照SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒說明進(jìn)行qRT-PCR檢測，以β-actin作為內(nèi)參基因。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min(1個循環(huán))；95 ℃變性20 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s(38個循環(huán))，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt法計算基因mRNA的相對表達(dá)水平。使用的引物序列為：Caveolin-1引物，上游5′- AGTTTCATCCAGCCACGGG-3′，下游5′-AATGTAATGGTGATCCACATGC-3′；β-actin引物，上游5′-ATCGTCCACCGCAAATGCTTCT-A-3′，下游5′- AGCCATGCCAATCTCATCTTGTT-3′。

1.2.4 Western blot 各處理組HSF細(xì)胞中加入RIPA 裂解液進(jìn)行裂解，提取各組細(xì)胞的總蛋白， Bradford法檢測其濃度。將提取的各組蛋白樣品以35 μg的量上樣，經(jīng)過10% SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，并轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。TBST 洗膜3 次，在室溫下加入5%山羊血清封閉 2 h，TBST洗膜3次，加入兔抗Caveolin-1(1∶500)、p16(1∶1 000)、p21(1∶1 000)、p38 MAPK(1∶1 000)、P-p38 MAPK(1∶1 000)、 p53(1∶1 000)作為一抗，并以GAPDH為內(nèi)參蛋白，4°C孵育過夜。第二日TBST 洗膜后，加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶5 000)作為二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜，滴加ECL 超敏發(fā)光液顯影后，蛋白條帶拍照，Image J軟件分析統(tǒng)計各條帶的灰度值。

1.2.5 MTT 法 取對數(shù)生長期的HSF細(xì)胞，并以1×104個/孔的密度接種到96 孔培養(yǎng)板中，按照1.2.2的方法進(jìn)行分組處理。處理結(jié)束后，加入 5 g/L MTT試劑液，在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h，添加150 μL DMSO溶液，置于恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育10 min，利用酶標(biāo)儀檢測 490 nm 波長下各孔細(xì)胞的吸光度值(OD值)，并計算各組細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)= 各處理組OD 值/對照組OD值×100%。

1.2.6 DCFH-DA染色收集 各處理組HSF細(xì)胞，采用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗后，以1×104個/孔的密度接種到 96 孔培養(yǎng)板中，加入終濃度為20 μmol/L的 DCFH-DA，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育35 min，離心后，PBS緩沖液清洗細(xì)胞，無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞，除去染液，利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察并拍攝圖像，隨機(jī)選擇3個視野，計數(shù)每個視野中的細(xì)胞數(shù)目，采用Image J軟件測定總熒光強(qiáng)度，并計算平均熒光強(qiáng)度。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù) 收集各處理組HSF細(xì)胞，使用胰蛋白酶對細(xì)胞進(jìn)行消化并離心，以Annexin V-FITC結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后，加入5 μL Annexin V-FITC試劑液，輕輕混勻，接著加入10 μL PI，室溫下避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.8 細(xì)胞SA-β-GAL 染色 取對數(shù)生長期的HSF細(xì)胞，并以1×104個/孔的密度接種到6 孔培養(yǎng)板中，按照1.2.2的方法處理后收集各組HSF細(xì)胞，PBS緩沖液清洗后，每孔加入1 mL SA-β-GAL試劑液，室溫孵育15 min，棄原液，PBS緩沖液洗滌，再加1 mL染色液，保鮮膜封孔后，將培養(yǎng)板放在37 ℃下過夜，次日，光學(xué)顯微鏡觀察染色結(jié)果并計數(shù)，衰老細(xì)胞呈深藍(lán)色。

2 結(jié)果

2.1 各組HSF細(xì)胞中Caveolin-1 mRNA與蛋白表達(dá)檢測 HSF細(xì)胞經(jīng)過不同處理后，實(shí)時熒光定量PCR和Western blot檢測各組細(xì)胞中Caveolin-1 mRNA與蛋白的表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染siRNA-Cav-1的細(xì)胞中Caveolin-1 mRNA相對表達(dá)量與蛋白相對表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)，而經(jīng)UVA處理的細(xì)胞中Caveolin-1 mRNA相對表達(dá)量與蛋白相對表達(dá)量均顯著上升(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染siRNA-Cav-1后再經(jīng)過UVA處理的細(xì)胞中Caveolin-1 mRNA相對表達(dá)量與蛋白相對表達(dá)量組均顯著下降(P<0.05，見圖1)。

A:Control ;B:SiRNA-Cav-1;C:UVA;D:SiRNA-Cav-1+UVA;*:與Control組比較, P<0.05;#:與 UVA組比較,P<0.05。圖1 各組HSF細(xì)胞中Caveolin-1 mRNA與蛋白表達(dá)檢測

2.2 siRNA 轉(zhuǎn)染對UVA誘導(dǎo)的HSF細(xì)胞存活率的影響 MTT檢測結(jié)果顯示，經(jīng)UVA處理的HSF細(xì)胞存活率較Control組顯著下降(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染siRNA-Cav-1的細(xì)胞存活率與Control 組無差異(P>0.05)；與UVA組比較，轉(zhuǎn)染siRNA-Cav-1后再經(jīng)過UVA處理的細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05，見圖2)。

*:與Control 組比較, P<0.05;#:與UVA組比較,P<0.05。圖2 各組HSF細(xì)胞存活率比較

2.3 siRNA 轉(zhuǎn)染對UVA誘導(dǎo)的HSF細(xì)胞ROS水平的影響 通過DCFH-DA染色檢測各組HSF細(xì)胞內(nèi)ROS水平，轉(zhuǎn)染siRNA-Cav-1的細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度較Control組無明顯變化(P>0.05)，經(jīng)UVA處理的細(xì)胞綠色熒光明顯增強(qiáng)，說明ROS水平增加(P<0.05)；轉(zhuǎn)染siRNA-Cav-1后再經(jīng)過UVA處理的細(xì)胞綠色熒光明顯減弱，ROS水平較UVA組下降(P<0.05，見圖3)。

*:與Control 組比較, P<0.05;#:與 UVA 組比較,P<0.05。圖3 DCFH-DA染色檢測各組HSF細(xì)胞內(nèi)ROS水平

2.4 siRNA 轉(zhuǎn)染對UVA誘導(dǎo)的HSF細(xì)胞凋亡水平的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組HSF細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA-Cav-1的HSF細(xì)胞凋亡率與Control 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，經(jīng)過UVA處理的細(xì)胞凋亡率較Control 組顯著增加(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染siRNA-Cav-1后再經(jīng)過UVA處理的細(xì)胞凋亡率較UVA處理后細(xì)胞凋亡率顯著減少(P<0.05，見圖4)。

*:與Control 組比較, P<0.05;#:與 UVA 組比較,P<0.05。圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組HSF細(xì)胞凋亡情況

2.5 siRNA 轉(zhuǎn)染對UVA誘導(dǎo)的HSF細(xì)胞衰老的影響 SA-β-GAL 染色檢測各組HSF細(xì)胞衰老情況，轉(zhuǎn)染siRNA-Cav-1后再經(jīng)過UVA處理的細(xì)胞SA-β-GAL染色陽性細(xì)胞較少，著色很淺，而UVA處理的細(xì)胞SA-β-GAL染色呈強(qiáng)陽性，衰老細(xì)胞所占比例較Control 組顯著增加(P<0.05)；轉(zhuǎn)染siRNA-Cav-1后再經(jīng)過UVA處理的細(xì)胞中SA-β-GAL染色陽性細(xì)胞較少，衰老細(xì)胞所占比例較UVA處理顯著下降(P<0.05，見圖5)。

*:與Control 組比較, P<0.05;#:與 UVA 組比較,P<0.05。圖5 SA-β-GAL 染色檢測各組HSF細(xì)胞衰老情況

2.6 siRNA轉(zhuǎn)染對UVA誘導(dǎo)的HSF細(xì)胞內(nèi)p16、p21、P-p38 MAPK及 p53蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，經(jīng)10 μmol/L p38 MAPK抑制劑SB203580處理48 h 的細(xì)胞內(nèi)p16、p21、p53蛋白表達(dá)以及p38 MAPK磷酸化水平較Control 組均顯著下調(diào)(P<0.05)，而經(jīng)UVA處理的細(xì)胞內(nèi)p16、p21、p53蛋白表達(dá)以及p38 MAPK磷酸化水平較Control 組均顯著上調(diào)(P<0.05)；經(jīng)過10 μmol/L p38 MAPK抑制劑SB203580處理48 h后再經(jīng)過UVA照射的細(xì)胞中，p16、p21、p53蛋白表達(dá)以及p38 MAPK磷酸化水平較單獨(dú)使用UVA照射的細(xì)胞均顯著下調(diào)(P<0.05)，且該作用效果與轉(zhuǎn)染siRNA-Cav-1后再經(jīng)過UVA處理的細(xì)胞中一致，見圖6。

A:Control 組;B:SB203580 組;C:UVA 組;D:SB203580+UVA組;E:siRNA-Cav-1+UVA 組；*:與control 組比較, P<0.05;#:與UVA 組比較,P<0.05。圖6 各組HSF細(xì)胞p16、p21、P-p38 MAPK及p53蛋白表達(dá)

3 討論

作為人體與周圍環(huán)境的界面，皮膚為人類提供了穩(wěn)定外部環(huán)境的保護(hù)性屏障，并在免疫中發(fā)揮一定的作用。人的皮膚主要由表皮、真皮以及皮下組織所組成，HSF細(xì)胞是真皮的主要基質(zhì)產(chǎn)生的細(xì)胞，并且主要受到其基質(zhì)環(huán)境的調(diào)節(jié)，可用于改善和指導(dǎo)皮膚傷口愈合過程，能夠過合成和降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的某些成分，例如膠原蛋白、彈性蛋白和糖胺聚糖等來維持皮膚狀態(tài)穩(wěn)定，在抗皮膚衰老與預(yù)防皮膚損傷中均起著重要作用[7]。當(dāng)皮膚屏障受損時，HSF細(xì)胞通過協(xié)調(diào)一系列反應(yīng)來修復(fù)損傷，主要包括止血、炎癥、上皮形成和細(xì)胞外基質(zhì)重塑[8]。因此，HSF細(xì)胞在維持皮膚組織完整性和抗老化中發(fā)揮著不可替代的作用，是研究皮膚衰老發(fā)生發(fā)展機(jī)制及采取治療措施的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

胞膜小窩是細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷所形成的直徑大小為50～100 nm的囊狀結(jié)構(gòu)，主要由脂類和蛋白質(zhì)組成，其中小窩蛋白(Caveolin)是胞膜小窩區(qū)別于其它脂筏結(jié)構(gòu)的特征性蛋白分子，在胞膜小窩的結(jié)構(gòu)功能中起著關(guān)鍵作用[9]。Caveolin-1 是Caveolin的一種亞型，存在于多種類型細(xì)胞中，作為細(xì)胞膜中必不可少的一種膜蛋白，其在多數(shù)細(xì)胞中呈高表達(dá)[10]。以往研究表明，Caveolin-1的主要功能可能是參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，而近期研究發(fā)現(xiàn)Caveolin-1能夠與多種蛋白質(zhì)相互作用，是細(xì)胞內(nèi)信號分子的轉(zhuǎn)導(dǎo)中心[11]。例如，細(xì)胞內(nèi)各種信號分子與Caveolin-1的支架區(qū)域結(jié)合形成復(fù)合體，從而抑制了關(guān)鍵信號蛋白分子的活性以負(fù)調(diào)節(jié)信號通路，從而抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞的成熟與分化[12]；另外，Caveolin-1還可能參與鈣通道活性的調(diào)節(jié)過程[13]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過UVA誘導(dǎo)的HSF細(xì)胞內(nèi)Caveolin-1表達(dá)明顯上調(diào)，這提示Caveolin-1可能參與調(diào)節(jié)HSF細(xì)胞的生理活性。接著通過轉(zhuǎn)染siRNA-Caveolin-1質(zhì)粒抑制HSF細(xì)胞中Caveolin-1表達(dá)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)UVA誘導(dǎo)的HSF細(xì)胞存活率增加，同時抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

適量ROS對維持機(jī)體或細(xì)胞穩(wěn)定起著有益作用，例如激活環(huán)氧合酶和脂氧合酶以及調(diào)節(jié)炎癥過程，但ROS的過量產(chǎn)生是皮膚老化過程中的關(guān)鍵病理與生理事件，能夠誘導(dǎo)并加速皮膚衰老[14]。光老化的發(fā)生也與ROS的產(chǎn)生有關(guān)，紫外線會導(dǎo)致ROS升高，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[15]。ROS通過激活相關(guān)信號通路，從而導(dǎo)致膠原蛋白的產(chǎn)生、基質(zhì)金屬蛋白酶合成減少以及基質(zhì)金屬蛋白酶的降解，從而導(dǎo)致結(jié)締組織降解，衰老相關(guān)分泌表型的產(chǎn)生，最終促進(jìn)了皮膚的衰老[16]。本研究結(jié)果顯示，在抑制Caveolin-1表達(dá)后經(jīng)過UVA照射的HSF細(xì)胞中ROS水平較只經(jīng)過UVA照射的HSF細(xì)胞明顯下降，由此表明抑制Caveolin-1表達(dá)可阻止HSF細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高，抑制細(xì)胞的老化。

衰老細(xì)胞的典型特征包括形態(tài)改變、SA-β-GAL活性升高、加速端粒的縮短和細(xì)胞增殖速率降低[8]。細(xì)胞衰老誘導(dǎo)涉及多種機(jī)制和途徑，p53、p21和p16是誘發(fā)細(xì)胞老化的刺激信號的關(guān)鍵蛋白。p53是衰老的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，p53/p21途徑可響應(yīng)DNA損傷和端粒磨損而促進(jìn)細(xì)胞衰老，p16同樣作為衰老細(xì)胞和衰老過程的生物標(biāo)志物，其調(diào)控十分復(fù)雜，涉及表觀遺傳控制和多種轉(zhuǎn)錄因子[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，p16、p21、p53蛋白表達(dá)以及p38 MAPK磷酸化水平均顯著下調(diào)，與使用p38 MAPK抑制劑SB203580的作用結(jié)果一致。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)在代謝、氧化還原反應(yīng)以及細(xì)胞生長中發(fā)揮功能，p38在氧化應(yīng)激中被相關(guān)激酶迅速磷酸化激活，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡并引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[18]。

綜上所述，在UVA誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞損傷老化后，通過靶向抑制 Caveolin-1表達(dá)可起到保護(hù)細(xì)胞的作用，其機(jī)制與降低細(xì)胞內(nèi)ROS 水平、抑制p16/p21/p53途徑的激活以及p38 MAPK磷酸化水平有關(guān)。本研究對于靶向Caveolin-1抗老化損傷效應(yīng)的研究及應(yīng)用提供理論依據(jù)。而在光老化關(guān)鍵信號路徑中相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，是否直接引起Caveolin-1表達(dá)產(chǎn)生變化以及具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究論證。