楊延 于龍鳳 王紹梅 李衛(wèi)娜 葛鋒

（1. 滇西科技師范學院，臨滄 677000；2. 西京學院，西安 710000；3. 昆明理工大學，昆明 650500）

三七［Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen］，又名田七、金不換、人參三七、血參、山漆等，是我國特有的五加科（Araliaceae）人參屬（Panax）藥用植物。三七在我國用于治療疾?。ㄓ绕涫堑驌p傷類疾病）已有600余年歷史，蜚聲中外的“片仔癀”、“云南白藥”等均含有三七。三七中的總皂苷是其主要藥效組分，研究顯示，三七總皂苷對于抗氧化［1］、降血脂［2］、抗腫瘤［3］、降血糖［4］及抗炎［5］等均表現(xiàn)出較好療效。然而，三七中所含總皂苷量偏低，如何采取有效措施增加三七中的皂苷量是目前關于三七的研究熱點之一。三七需較特殊的生長環(huán)境，因此其種植區(qū)域較為局限，加之其生長周期長（一般需3-5年）、需輪作種植、種植過程存在品種退化和農(nóng)藥、重金屬殘留超標等問題使得通過人工大規(guī)模種植三七以提取獲得大量總皂苷的路徑受阻。此外，三七總皂苷的組成成分較為復雜，使得人工化學合成手段面臨合成工藝繁雜、生產(chǎn)成本偏高以及污染環(huán)境等諸多難題。鑒于此，有研究者轉(zhuǎn)而借助生物技術深入探索三七總皂苷的生物合成途徑，試圖通過尋找途徑當中的若干個關鍵限速酶，克隆并超表達這些酶的編碼基因，最終提高皂苷產(chǎn)量［6-8］。截止目前，本課題組已完成對三七皂苷生物合成途徑中FPS和SS基因的功能探索，證實兩者均為途徑中的關鍵限速酶編碼基因［9-10］。本研究在此基礎上，通過在三七細胞內(nèi)共超表達FPS和SS基因，探究兩基因在皂苷合成途徑當中的聯(lián)合調(diào)控效應，為未來三七皂苷的同源或者異源合成體系的構建奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料、菌株及載體 植物材料：未轉(zhuǎn)基因三七細胞（由子葉誘導獲得）、轉(zhuǎn)SS三七細胞均為本實驗室所保藏。

菌株：Trans1-T1購自北京Transgen公司，Agrobacterium tumefaciens EHA105為本實驗室所保藏。

載體：pGEM-T Easy Vector購自美國Promega公司，pCAMBIA1300S為本實驗室所保藏。

1.1.2 主要試劑 酶：Ex Taq/Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、Kpn I、Xba I限制性內(nèi)切酶均購自日本TaKaRa公司。

抗 生 素 ：Cefotaxime Na Salt（Cef）、Ampicillin（Amp）、Kanamycin（Kan）均購自安徽Biosharp公司，Hygromycin B（Hyg B）購自上海Sangon公司，Rifampicin（Rif）購自美國Sigma公司。

試劑盒：質(zhì)粒抽提、膠回收試劑盒均購自上海Sangon公司，GoTaq? 2-Step RT-qPCR System試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 三七總RNA的提取及cDNA的合成 利用部分步驟稍經(jīng)改良的異硫氰酸胍提取法［11］提取0.2 g未轉(zhuǎn)基因細胞中的總RNA，并以此為模版，以Oligo（dT）15為引物，經(jīng)M-MLV催化合成第一鏈cDNA。

1.2.2 三七FPS基因編碼區(qū)序列的克隆 根據(jù)GenBank中發(fā)布的三七FPS基因編碼區(qū)序列（KC953034.1）及pCAMBIA1300S載體上的酶切位點設計一對特異性引物，上游引物為FPSf：5′-GG TACCAGAATGAGCGATCTGAAGACGAG-3′，下游引物 為 FPSr：5′- TCTAGAACAGACAACAACTTCCCC TCCAT-3′。以1.2.1步驟合成的cDNA為模板，進行PCR 反應（50.0 μL），條件為 ：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min 20 s，32 個循環(huán) ；72℃ 15 min。膠回收PCR產(chǎn)物，將回收物連接至pGEM-T Easy Vector上，后轉(zhuǎn)化Trans1-T1細胞，經(jīng)LB平板（Amp，100 mg/L）篩選培養(yǎng)后，挑選菌液PCR為陽性的單克隆進行測序鑒定。將測序結果與GenBank中發(fā)布的KC953034.1序列進行比對。

1.2.3 pCAMBIA1300S-FPS超表達載體的構建 利用Xba I、Kpn I同時雙酶切pGEM-FPS和pCAMBIA1300S，通過T4DNA連接酶將對應的酶切片段連接，連接物轉(zhuǎn)化Trans1-T1細胞，經(jīng)LB平板（Kan，50 mg/L）篩選培養(yǎng)之后，挑取菌液PCR為陽性的單克隆再次進行質(zhì)粒雙酶切確認。

1.2.4 pCAMBIA1300S-FPS超表達載體的遺傳轉(zhuǎn)化 將pCAMBIA1300S-FPS借助CaCl2凍融法導入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞內(nèi)，以獲得目標菌株EHA105-pCAMBIA1300S-FPS。將已轉(zhuǎn)SS的三七細胞（為本實驗保藏）置于預培養(yǎng)基（配方詳見表1，下同）上，避光培養(yǎng)3 d。收集經(jīng)預培養(yǎng)后的三七細胞，將該細胞浸泡于A600為0.6-0.8的EHA105-pCAMBIA1300S-FPS菌液中進行侵染，侵染過程保持溫度28℃，轉(zhuǎn)速100 r/min，侵染時間持續(xù)15 min。收集經(jīng)過浸泡侵染的三七細胞并將其表面附著菌液吸干，之后將該細胞置于共培養(yǎng)基上，避光培養(yǎng)3 d。用添加了400 mg/L Cef的高溫滅菌蒸餾水洗滌經(jīng)共培養(yǎng)后的三七細胞，次數(shù)3-5次。經(jīng)過洗滌的細胞在除菌培養(yǎng)基上避光培養(yǎng)14 d。將經(jīng)過除菌培養(yǎng)后存活下來的細胞轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上，避光篩選培養(yǎng)若干代，每代培養(yǎng)周期約35-50 d，大約篩選5-7代。

表1 三七細胞培養(yǎng)基配方Table 1 Formulas of P. notoginseng culture media

1.2.5 轉(zhuǎn)FPS、SS陽性細胞系的基因組PCR篩選 根據(jù)pCAMBIA2300S-SS載體（存在于轉(zhuǎn)SS細胞中）和pCAMBIA1300S-FPS載體上分別含有的npt II和hpt II篩選標記基因序列設計兩對特異引物（表 2）。

表2 基因組PCR引物序列Table 2 Primers used for genomic PCR

提取1.2.4步驟篩選到的轉(zhuǎn)基因細胞基因組DNA，將此作為模版，同時利用表2所示引物進行npt II和 hpt II篩選標記基因 PCR 擴增（20.0 μL），從而鑒別篩選到的細胞是否已成功轉(zhuǎn)入pCAMBIA2300S-SS和pCAMBIA1300S-FPS載體。PCR條件為 ：94℃ 5 min ；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，32個循環(huán)；72℃ 15 min。

1.2.6 轉(zhuǎn)FPS、SS陽性細胞系中兩基因相對表達量的qRT-PCR檢測 按前述方法提取基因組PCR檢測結果為陽性的轉(zhuǎn)基因三七細胞總RNA，依照GoTaq?2-Step RT-qPCR System試劑盒說明書進行qRT-PCR擴增（20.0 μL），反應以GAPDH為內(nèi)參基因，所用引物序列詳見表3，反應條件為：95℃ 2 min；95℃15 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，共 40 個循環(huán)。

表3 qRT-PCR引物序列Table 3 Primers used for qRT-PCR

1.2.7 轉(zhuǎn)FPS、SS陽性細胞系中總皂苷及部分單體含量的測定 各稱取0.1 g未轉(zhuǎn)基因、僅轉(zhuǎn)SS以及同時轉(zhuǎn)FPS、SS三七細胞粉末至離心管中，往管中各加入10 mL 70%甲醇溶液浸泡過夜。對浸泡后細胞液進行常溫超聲波提取60 min。提取結束后，將過濾獲得的細胞液50℃烘干至恒量。加10 mL無菌水溶解烘干殘余物，接著再用水飽和正丁醇萃取3次，每次用量約10 mL，合并3次萃取液并將其50℃烘干至恒量。加適量甲醇溶液溶解烘干殘余物，最終將該溶液定容至5 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，最終所得濾液即為三七細胞皂苷溶液。

采用香草醛-高氯酸-冰醋酸分光光度法［12］測定未轉(zhuǎn)基因、僅轉(zhuǎn)SS以及同時轉(zhuǎn)FPS、SS三七細胞皂苷溶液中的總皂苷量。采用HPLC法測定Rh1、Rg1、Re、Rd、Rb1五種重要單體皂苷量，具體操作如下：精確稱量適量的Rh1、Rg1、Re、Rd、Rb1單體皂苷標準品，將各標準品混合并加1 mL甲醇使其完全溶解，獲得的混合溶液即為混合皂苷標準品溶液。分別移取4、6、8、10、15、20、25、30 mL混合標準液，將其注入HPLC儀中進行檢測，檢測條件為：色譜柱 Waters Symmetry C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；柱溫 35℃；流動相 乙腈和水，乙腈∶水梯度洗脫（V/V）順序見表4；進樣量 20 μL，流速 1.0 mL/min；檢測波長 203 nm。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制各單體皂苷的標準曲線及獲得相應的線性回歸方程。取20 μL經(jīng)上述操作步驟獲得的三七細胞皂苷溶液，將其注入HPLC儀中進行檢測。

表4 乙腈∶水梯度洗脫表Table 4 Elution gradient of acetonitrile to water

2 結果

2.1 三七FPS基因編碼區(qū)序列的克隆及pCAMBIA-1300S-FPS超表達載體的構建與鑒定

將未轉(zhuǎn)基因三七細胞總RNA作擴增模板，經(jīng)RT-PCR反應后克隆到一條約1 200 bp的基因序列，符合預期大小。將該序列測序后與GenBank中的KC953034.1序列作比對，測序結果與KC953034.1序列完全一致。

將測序無誤的FPS編碼區(qū)序列與線狀pCAMBIA1300S（8 959 bp）連接，雙酶切連接得到的重組載體，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳產(chǎn)生兩條約9 000 bp和1 200 bp的DNA片段，符合預期大小，表明pCAMBIA1300S-FPS超表達載體已被成功構建。

2.2 轉(zhuǎn)FPS、SS陽性細胞系的基因組PCR篩選

雙抗生素（Kan和Hyg B）篩選5輪后，獲得了7株轉(zhuǎn)雙基因細胞。由于pCAMBIA2300S-SS載體和pCAMBIA1300S-FPS載體上分別含有npt II和hpt II篩選標記基因，pCAMBIA2300S-SS載體上的外源SS基因與npt II基因位于同一T-DNA中，pCAMBIA1300S-FPS載體上的外源FPS基因同樣與hpt II基因位于同一T-DNA中，因此，以各轉(zhuǎn)雙基因細胞系的基因組DNA作為模板，通過對npt II和hpt II篩選標記基因進行基因組PCR分析，就可間接確認外源SS基因和FPS基因是否已成功與三七細胞基因組整合。轉(zhuǎn)雙基因細胞基因組PCR結果見圖1和圖2。由兩圖可知，從7株細胞基因組中都克隆到兩條長度均為450 bp左右的npt II和hpt II篩選標記基因片段，符合預期大小，證實pCAMBIA2300SSS和pCAMBIA1300S-FPS已被轉(zhuǎn)入7株三七細胞中。

圖1 轉(zhuǎn)基因細胞系中npt II基因的基因組PCR檢測Fig. 1 Genomic PCR detection of npt II in transgenic cell lines

圖2 轉(zhuǎn)基因細胞系中hpt II基因的基因組PCR檢測Fig. 2 Genomic PCR detection of hpt II in transgenic cell lines

2.3 轉(zhuǎn)FPS、SS陽性細胞系中兩基因相對表達量的qRT-PCR檢測及皂苷含量的測定

雙抗生素篩選5輪后獲得的7株細胞中，有3株因生長速度過慢而無法進行后續(xù)檢測，顧被棄之，留剩余4株細胞，并對其進行編號，編號依次為T-1，T-2，T-3，T-4（圖 3）。

圖3 三七細胞Fig. 3 P. notoginseng cells

對4株細胞進行qRT-PCR分析。結果顯示，F(xiàn)PS，SS及GAPDH基因的擴增效率均在有效統(tǒng)計范圍之內(nèi)；溶解曲線有單一峰，綜合表明qRT-PCR反應無非特異性擴增干擾。

T-1、T-2、T-3、T-4、未轉(zhuǎn)基因細胞及僅轉(zhuǎn)SS細胞中的FPS和SS基因表達差異見圖4。

圖4 三七細胞中FPS和SS基因的相對表達量Fig. 4 Relative transcription levels of FPS and SS in P. notoginseng cells

根據(jù)圖4知，在4株轉(zhuǎn)FPS、SS細胞中，F(xiàn)PS的相對表達量均比兩對照（未轉(zhuǎn)基因細胞和僅轉(zhuǎn)SS細胞）高，最高分別是未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.26倍和僅轉(zhuǎn)SS對照的3.74倍；SS的相對表達量與僅轉(zhuǎn)SS對照相比無顯著差異，但均比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ崭摺?/p>

T-1、T-2、T-3、T-4、未轉(zhuǎn)基因細胞及僅轉(zhuǎn)SS細胞中的總皂苷和部分單體皂苷含量測定結果如圖5和圖6所示。

圖5 三七細胞中總皂苷含量Fig. 5 Contents of PNS in P. notoginseng cells

圖6 三七細胞中部分單體皂苷含量Fig. 6 Contents of monomer saponins in P. notoginseng cells

根據(jù)圖5可知，以未轉(zhuǎn)基因及僅轉(zhuǎn)SS三七細胞為對照，4株轉(zhuǎn)雙基因陽性細胞中的總皂苷量均有不同幅度增加，其中，T-2中總皂苷量最高，為64.48 mg/g干重，分別是未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.46倍和僅轉(zhuǎn)SS對照的1.73倍；T-1中的總皂苷量次之，為58.86 mg/g干重，分別為未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.26倍和僅轉(zhuǎn)SS對照的1.63倍。

由圖6可知，從4株轉(zhuǎn)雙基因陽性細胞中均可檢測到單體皂苷：Re、Rb1、Rh1、Rd和Rg1，且對比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，僅T-3中的Rb1含量出現(xiàn)下降趨勢，其余細胞中的上述5種單體皂苷量均呈現(xiàn)出不同程度的增幅，其中以Re的增幅最為顯著。

3 討論

FPS被普遍認為是植物三萜皂苷合成途徑中的一個關鍵酶，由FPS催化生成的產(chǎn)物——法呢基焦磷酸可同時為倍半萜等及三萜皂苷提供合成前體（圖7）。目前，有關FPS基因功能的研究較多，并取得了一些成果：楊林林等［13］研究發(fā)現(xiàn)，在與三七親緣關系較近的人參根中，F(xiàn)PS的相對表達量與人參皂苷Rb3的積累量呈顯著正相關。Kim等［14］向人參發(fā)根中導入人參FPS基因超表達載體，實現(xiàn)了人參發(fā)根細胞中FPS的超表達，同時使得人參皂苷的含量也得到顯著提升，最高可達到野生型對照的3倍以上。劉美佳等［15］向與三七同屬的珠子參細胞中轉(zhuǎn)入珠子參FPS基因超表達載體，同樣使得珠子參細胞中的FPS相對表達量及三萜皂苷含量顯著提高，最高為未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?倍。本課題組前期構建了三七FPS基因超表達載體并將其轉(zhuǎn)入三七細胞內(nèi)，結果顯示，轉(zhuǎn)基因三七細胞中的FPS均得到超表達，且細胞中的總皂苷量和部分單體皂苷量均高于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，總皂苷量最高為對照?.09倍［9］。SS被認為是植物三萜皂苷合成途徑中的又一個關鍵酶，由其催化生成的產(chǎn)物——鯊烯為植物甾醇和三萜皂苷的共同合成前體（圖7）。近年來，針對SS基因的功能研究發(fā)現(xiàn)主要有：邢朝斌等［16］通過分析刺五加不同器官、不同生長發(fā)育階段及茉莉酸甲酯處理對SS家族的兩個基因SS1和SS2表達水平及總皂苷含量的影響，揭示了SS1基因的表達水平高低與總皂苷含量呈顯著正相關。孫穎等［10］將三七SS基因超表達載體導入三七細胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)所有轉(zhuǎn)基因細胞中的總皂苷含量及Rh1、Rh2、Rg1、Rb1、F1、Re等單體皂苷含量均顯著增加。

圖7 三七總皂苷生物合成途徑Fig. 7 Biosynthetic pathway of PNS in P. notoginseng

此外，本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，三萜皂苷合成途徑中雙基因甚至更多基因之間可能存在正協(xié)同調(diào)控效應［8，17］，因此，為了探清FPS、SS這兩個關鍵酶對皂苷合成的聯(lián)合調(diào)控效果如何，本研究構建了pCAMBIA1300S-FPS載體，并通過EHA105菌株轉(zhuǎn)化已轉(zhuǎn)SS的三七細胞，經(jīng)雙抗生素（Kan和Hyb B）篩選、基因組PCR鑒定，初步獲得7株同時轉(zhuǎn)FPS和SS的細胞系，其中3株因生長速度過慢，難以滿足后續(xù)實驗要求，將其舍棄，留下4株轉(zhuǎn)雙基因細胞系進一步進行qRT-PCR鑒定。在進行qRT-PCR分析時，不同細胞系之間可能存在RNA質(zhì)量、產(chǎn)量和逆轉(zhuǎn)錄效率等方面的差異，由此可能會導致不同細胞系之間的目標基因表達差異難以被獲得，因此，需一個內(nèi)參基因?qū)ζ溥M行校正。研究顯示，利用三七GAPDH基因作為qRT-PCR分析的內(nèi)參基因時，可獲得特異性較高、穩(wěn)定性較好的實驗效果［18］。因此本研究將GAPDH為內(nèi)參基因進行qRT-PCR分析。

4株轉(zhuǎn)雙基因細胞中FPS相對表達量均較對照更高，表明4株細胞均實現(xiàn)了FPS超表達。然而，4株細胞中FPS的相對表達量存在一定差異，分析導致差異存在的原因可能是外源FPS在不同細胞基因組中插入的位點不同而導致的；此外，細胞的生長狀態(tài)也可能是致使差異存在的一個原因。4株轉(zhuǎn)雙基因細胞中SS的相對表達量較僅轉(zhuǎn)SS細胞而言，無顯著差別，表明4株轉(zhuǎn)雙基因細胞中pCAMBIA2300S-SS載體和pCAMBIA1300S-FPS載體的超表達互不干擾，此為未來進一步利用組合生物合成技術構建三七皂苷同源或者異源合成體系的重要前提。

總皂苷量測定結果顯示，4株轉(zhuǎn)雙基因細胞中的總皂苷量較對照均有不同幅度增加，結合qRTPCR分析結果可知：在三七細胞中共超表達FPS和SS確實可有效提高FPS和SS的轉(zhuǎn)錄水平，從而打破由FPS和SS兩個限速酶催化的限速反應束縛，促使皂苷合成代謝流得到強化，且共超表達雙基因可進一步提升皂苷含量。

Re、Rb1、Rh1、Rd和Rg1是三七中藥用價值較高的單體皂苷，研究證明Rh1在抗神經(jīng)衰退及抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用［19］；Rg1及Rd對心血管及中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有特殊保護作用［20-21］；Re可有效降低血液中葡萄糖和膽固醇濃度［22］；Rb1對治療腦水腫、動脈血管痙攣效果顯著［23］。對三七細胞中的這5種重要單體皂苷含量進行分析，結果顯示4株轉(zhuǎn)雙基因細胞中均可檢測到上述5種單體皂苷，對比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，僅T-3中的Rb1含量出現(xiàn)下降趨勢，推測可能的原因是pCAMBIA1300S-FPS載體隨機插到T-3基因組上的位點影響到了合成Rb1相關酶基因的表達；其余細胞中的上述5種單體皂苷量均呈現(xiàn)出不同程度的增幅，其中以Re的增幅最為顯著，推測可能的原因是：外源FPS片段在轉(zhuǎn)基因細胞基因組中的插入位點對Re合成酶編碼基因的表達具有一定激活作用，后續(xù)需進一步對該推測進行實驗驗證。

張萍等［24］研究證明3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）是三萜皂苷合成途徑中的關鍵酶之一，進一步在三七細胞中共超表達三七HMGR基因和SS基因，結果顯示，轉(zhuǎn)雙基因細胞系中的總皂苷含量是僅轉(zhuǎn)SS細胞的1.5倍，是未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.0倍，再次證實雙基因之間存在正協(xié)同調(diào)控效應。然而，對比共超表達FPS、SS引起的總皂苷含量增幅，在三七細胞中共超表達HMGR和SS引起的增幅要更低些，推測可能的原因是：與HMGR相比，F(xiàn)PS位于皂苷合成途徑中靠中游的位置，由其催化合成的反應中間物可為皂苷合成提供更為直接的前體；HMGR則位于較上游的位置，中間的合成步驟較多也較復雜，從而導致皂苷含量增幅稍小。此外，與共超表達SS、DS引起的總皂苷含量增幅相比，共超表達FPS SS引起的增幅與之相差較小，推測可能的原因是：FPS催化中游合成途徑的第一個限速反應，DS則是進入達瑪院型皂苷合成的分支，兩者在三萜皂苷合成途徑中均發(fā)揮較重要的作用，下一步可嘗試3個或更多關鍵酶基因共超表達，以期獲得更高皂苷表達水平的轉(zhuǎn)基因三七細胞。

4 結論

在三七細胞中共超表達FPS、SS，可有效提高細胞中的總皂苷和部分單體皂苷量；此外，與僅超表達SS比較，共超表達FPS、SS能夠進一步提高皂苷含量。