何佛容，陳 馳，潘媛媛，鄧勝男，施 勇，陶雪飛

衰老是心血管疾病的危險因素之一[1]。心臟衰老的主要特征是舒張功能障礙、收縮力下降、脂質(zhì)積聚、氧化應(yīng)激、成纖維細(xì)胞的分泌異常、自噬減少和蛋白激酶途徑信號的改變[2]。此外，衰老引起心房、心室、心肌等結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)、血管系統(tǒng)的功能障礙[3]，嚴(yán)重威脅人們的健康。隨著世界老年人口的增加，尋找緩解心臟老化、保護(hù)心臟功能的方法具有重要意義。

蟲草素(cordycepin, Cor)是德國科學(xué)家Cunningham et al[4]從蛹蟲草中提取的核苷類抗生素，具有抗氧化、抗衰老、抗菌、抗炎、抗癌等廣泛藥理活性[5]。Cor在營養(yǎng)保健和臨床治療方面具有巨大的潛力及研究價值。其中，Cor通過激活A(yù)kt/GSK-3β/p70S6K信號通路和HO-1表達(dá)，緩解大鼠心臟缺血/再灌注損傷[6]，但未見Cor在心臟衰老方面的報道。該研究探討Cor對老年大鼠心臟功能的保護(hù)作用及其機(jī)制，以期為臨床治療提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物50只雄性SPF級SD大鼠，其中10只3月齡大鼠作為青年對照組，體質(zhì)量(280±35.3) g，40只20 ～ 22月齡大鼠作為老年組，體質(zhì)量(685±52.6) g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分組。所有大鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0011。動物實驗遵循3R原則，給予動物人道關(guān)懷。

1.2 藥物與試劑Cor購自上海源葉生物(貨號B20196)；肌鈣蛋白I(cardiac troponin Ⅰ，cTnI)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB，CK-MB)、肌紅蛋白(myohemoglobin，Mb)試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司(貨號：JLC6968、JLC662、JLC6960)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(貨號：ml076328、ml077384、ml076593)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(貨號：T2190)；裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(cleaved cysteine aspartic protease 9，cleaved Caspase 9)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(cysteine aspartic protease 9，Caspase-9)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteine aspartic protease 3，Caspase-3)等相關(guān)抗體購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司；核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)、醌氧化還原酶1(quinone oxidoreductase 1，NQO1)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)等相關(guān)抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；RIPA裂解液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司(貨號：C1053-500、)；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量檢測試劑盒購自上海炎熙生物科技有限公司(貨號：PD-BCA-500)；4%多聚甲醛、二甲苯、乙醇、蘇木精-伊紅溶液購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(貨號：C104190、X139941、E111994、E196384)。

1.3 主要儀器SA703小動物霧化給藥儀購自江蘇賽昂斯生物科技有限公司；MR-96T酶標(biāo)儀購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；EG1150石蠟包埋機(jī)購自德國萊卡Leica公司；S700A旋轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)購自深圳瑞沃德生命技術(shù)有限公司；ZX-S24恒溫水浴鍋購自上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司；XSP-8CA顯微鏡購自上海光學(xué)儀器廠；P6-VET實驗動物超聲診斷儀購自江蘇大為醫(yī)療有限公司。

1.4 方法

1.4.1動物分組與造模 參考文獻(xiàn)[7]，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將10只青年大鼠作為青年對照組；將40只老年大鼠隨機(jī)均分成4組，分別為老年模型組、Cor低劑量組、Cor中劑量組、Cor高劑量組。各給藥組分別灌胃 5、10、20 mg/kg Cor，老年組與青年組灌胃等量的生理鹽水，1次/d，共4周。各組大鼠室溫飼養(yǎng)，正常自由飲水進(jìn)食。末次給藥后麻醉，進(jìn)行超聲心動圖檢測，腹主動脈取血后處死，解剖取心臟，冷的生理鹽水清洗后，取部分用4%多聚甲醛固定，剩余組織制備勻漿待用。

1.4.2超聲心動圖檢測大鼠心臟功能 各組大鼠吸入異氟烷霧化氣體麻醉后，對左前胸區(qū)域脫毛處理，仰臥位固定于加熱板上，設(shè)置溫度為37 ℃，腹部朝上，稍微向左傾斜，實時監(jiān)測心電圖，并進(jìn)行超聲檢查。大鼠胸部涂耦合劑，將超聲診斷儀的探頭放置在心臟胸骨左緣并移至乳頭肌水平，分別運(yùn)用二維B型超聲及M型超聲，顯示并記錄左室短軸切面及左心室運(yùn)動曲線，獲得大鼠的心率(heart rate，HR)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、短軸收縮率(fractional shortening，F(xiàn)S)指標(biāo)數(shù)據(jù)。

1.4.3ELISA法檢測血清中心臟功能損傷標(biāo)志物水平和氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平 取血后，離心收集上清液。按照cTnI、CK-MB、Mb、SOD、MDA、LDH試劑盒說明書進(jìn)行操作。將樣品放入反應(yīng)孔孵育45 min后洗滌。加入生物素標(biāo)記的抗體反應(yīng)30 min，顯色劑15 min。加入終止液，采用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。

1.4.4HE染色觀察心臟組織病理形態(tài) 取出固定的組織，修剪后進(jìn)行脫水透明處理，用梯度乙醇從低濃度到高濃度浸洗，隨后浸入二甲苯中，10 min后浸入蠟中。采用石蠟包埋機(jī)對浸蠟后的標(biāo)本做進(jìn)一步包埋，冷卻1 h后進(jìn)行切片，并平鋪于35～38 ℃的水面上，使蠟片自然展平，取出蠟片置于載玻片上，用濾紙吸收多余的水分，移至恒溫箱中烘烤15～20 min進(jìn)行脫蠟處理，最后使用蘇木精-伊紅溶液進(jìn)行染色，使用顯微鏡觀察并拍照分析。

1.4.5TUNEL染色觀察心肌細(xì)胞凋亡情況 制作石蠟切片后進(jìn)行脫蠟、水合、透明處理，在標(biāo)本上分別加入TUNEL反應(yīng)混合液，加入蓋玻片反應(yīng)1 h, 隨后用PBS溶液漂洗3次，加入DAB底物反應(yīng)10 min后漂洗3次。用顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)。

1.4.6Western blot檢測心肌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 取制備的心臟組織勻漿液，加入RIPA裂解液，冰浴、離心后用BCA試劑盒測定蛋白濃度，煮沸變性后獲取上樣樣本，經(jīng)SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后，采用cleaved Caspase 9、cleaved Caspase 3、Caspase 3、Nrf2、NQO1、HO-1等相關(guān)一抗進(jìn)行孵育，4 ℃過夜，TBST溶液洗滌3次后采用相關(guān)二抗進(jìn)行孵育，1.5 h后加入發(fā)光液，顯色處理，并統(tǒng)計灰度值，計算相應(yīng)蛋白表達(dá)量，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 Cor對老年大鼠心臟功能的影響與青年對照組相比，老年模型組HR、LVEF、FS的水平降低(P<0.05)，與老年模型組相比，Cor中、高劑量組HR、LVEF、FS的水平升高(P<0.05)，見表1。提示Cor能夠緩解心臟功能指標(biāo)的降低，在一定程度上改善心臟收縮、舒張功能。

表1 Cor對老年大鼠心臟功能的影響

2.2 Cor對老年大鼠心臟功能損傷標(biāo)志物水平的影響cTnI、CK-MB、Mb是心臟功能損傷標(biāo)志物。與青年對照組相比，老年模型組CK-Mb、Mb、cTnI 的水平升高(P<0.05)，與老年模型組相比，Cor中、高劑量組CK-Mb、Mb、cTnI 的水平降低(P<0.05)，見表2。提示Cor能夠降低心臟功能損傷標(biāo)志物水平。

表2 Cor對老年大鼠心臟功能損傷標(biāo)志物水平的影響

2.3 Cor對老年大鼠心臟組織病理學(xué)的影響青年對照組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞無腫脹、變性壞死；老年模型組心肌細(xì)胞排列疏松紊亂，有空泡樣變性，部分心肌溶解壞死，肌纖維肥大斷裂；Cor各給藥組與老年模型組相比，細(xì)胞排列紊亂、腫脹、壞死，肌纖維自溶、斷裂的現(xiàn)象減輕，見圖1。提示Cor能夠緩解組織結(jié)構(gòu)的紊亂和病變，改善心肌細(xì)胞損傷。

圖1 Cor對老年大鼠心臟組織病理學(xué)的影響 ×400A:青年對照組；B：老年模型組；C：Cor低劑量組；D：Cor中劑量組；E：Cor高劑量組

2.4 Cor對老年大鼠心臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響與青年對照組相比，老年模型組MDA、LDH 的含量升高，SOD的活性降低(P<0.05)；與老年模型組相比，除Cor低劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，Cor中、高劑量組MDA、LDH 的含量降低，SOD的活性升高(P<0.05)，見表3。提示Cor能夠緩解心臟組織氧化應(yīng)激反應(yīng)。

表3 Cor對老年大鼠心臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

2.5 Cor對老年大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響青年對照組正常心肌細(xì)胞核呈淡藍(lán)色；老年模型組心肌細(xì)胞核偏褐色，染色質(zhì)積聚成致密的團(tuán)塊，胞質(zhì)有部分黃染，提示有大量凋亡細(xì)胞；與老年模型組相比，Cor各給藥組細(xì)胞凋亡減少，見圖2。提示Cor緩解老年大鼠心肌細(xì)胞的凋亡。

圖2 Cor對老年大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 ×200A:青年對照組；B：老年模型組；C：Cor低劑量組；D：Cor中劑量組；E：Cor高劑量組

2.6 Cor對老年大鼠心肌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與青年對照組相比，老年模型組cleaved Caspase 9/Caspase9、cleaved Caspase 3/Caspase 3的表達(dá)升高(P<0.05)；與老年模型組相比，除Cor低劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，Cor中、高劑量組cleaved Caspase 9/Caspase 9、cleaved Caspase 3/Caspase 3的表達(dá)降低(P<0.05)，見圖3。提示Cor能夠抑制老年大鼠心肌細(xì)胞凋亡，緩解心臟功能損傷，與2.5項結(jié)果一致。

圖3 Cor對老年大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響A：青年對照組；B：老年模型組；C：Cor低劑量組；D：Cor中劑量組；E：Cor高劑量組；與青年對照組比較：*P<0.05；與老年模型組比較：#P<0.05

2.7 Cor對老年大鼠心肌細(xì)胞中Nrf2/HO-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與青年對照組相比，老年模型組p-Nrf2/Nrf2、NQO1、HO-1的表達(dá)降低(P<0.05)；與老年模型組相比，Cor中、高劑量組p-Nrf2/Nrf2、NQO1、HO-1的表達(dá)升高(P<0.05)，見圖4。提示Cor對老年大鼠心臟功能具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)Nrf2/HO-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。

圖4 Cor對老年大鼠心肌細(xì)胞Nrf2/HO-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響A：青年對照組；B：老年模型組；C：Cor低劑量組；D：Cor中劑量組；E：Cor高劑量組；與青年對照組比較：*P<0.05；與老年模型組比較：#P<0.05

3 討論

Cor在治療人類疾病中具有良好的藥用潛力。其中，Cao et al[8]的研究顯示，Cor通過體內(nèi)外自噬誘導(dǎo)對糖尿病腎病有良好的治療效果；Han et al[9]的報道表明，Cor通過調(diào)節(jié)炎癥、凋亡和氧化應(yīng)激作用緩解腎臟缺血損傷；Wang et al[10]的研究指出，Cor通過激活A(yù)MPKα通路改善心肌肥厚程度。本研究結(jié)果顯示，Cor干預(yù)治療后HR、LVEF、FS的水平升高；細(xì)胞排列紊亂、腫脹、壞死，肌纖維自溶、斷裂的現(xiàn)象減輕； CK-Mb、Mb、cTnI 的水平降低。實驗提示，Cor能夠緩解心臟功能指標(biāo)的降低，在一定程度上改善心臟收縮、舒張功能；能夠降低心臟功能損傷標(biāo)記物水平；能夠緩解組織結(jié)構(gòu)的紊亂和病變，改善心肌細(xì)胞損傷。

細(xì)胞氧化應(yīng)激會引起蛋白質(zhì)損傷、脂質(zhì)紊亂、DNA突變等有害的生化反應(yīng)。其中，SOD在保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基的毒害中發(fā)揮著重要作用，但隨著年齡的增長，體內(nèi)SOD的含量呈下降趨勢，增長的自由基會破壞機(jī)體的平衡，使機(jī)體產(chǎn)生各種疾病[11]。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量反映組織過氧化的程度[12]。LDH主要存在于胞質(zhì)內(nèi)，不能通過細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞受損或凋亡時才被釋放，因此，LDH水平與細(xì)胞凋亡程度成正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，Cor干預(yù)治療后MDA、LDH 的含量降低，SOD的活性升高，提示Cor能夠緩解心臟組織氧化應(yīng)激反應(yīng)。

細(xì)胞凋亡具有調(diào)控細(xì)胞衰老和程序性死亡的效應(yīng)，可及時清除機(jī)體內(nèi)多余和受損傷的細(xì)胞，維持組織器官的穩(wěn)定性。細(xì)胞凋亡主要由Caspase蛋白酶家族所調(diào)控，當(dāng)細(xì)胞接收到刺激信息，促進(jìn)凋亡小體的生成，通過自我剪切方式活化Caspase 9，Caspase 9進(jìn)一步對下游Caspase 3進(jìn)行活化?；罨腃aspase 3可促使相關(guān)蛋白表達(dá)，cleaved Caspase 3進(jìn)一步破壞細(xì)胞骨架及管家基因的功能，影響正常細(xì)胞信號的傳遞、周期的調(diào)控，使細(xì)胞出現(xiàn)核凝結(jié)、核裂解等凋亡形態(tài)學(xué)上的改變。本研究結(jié)果顯示，Cor干預(yù)治療后cleaved Caspase 9/Caspase 9、cleaved Caspase 3/Caspase 3的表達(dá)降低，提示Cor能夠抑制老年大鼠心肌細(xì)胞凋亡，緩解心臟功能損傷。

Nrf2是一種抗氧化轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)機(jī)體受到不利刺激時，啟動下游HO-1、NQO1及SOD等抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄。HO-1在體內(nèi)具有抗氧化、細(xì)胞保護(hù)作用，可清除氧自由基，阻止脂質(zhì)過氧化。Cor通過Nrf2/HO-1途徑緩解脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷[13]；通過Nrf2和AMPK抑制細(xì)胞衰老，進(jìn)而達(dá)到預(yù)防輻射潰瘍的作用[14]；通過Nrf2/HO-1/NF-κB通路發(fā)揮抗肝癌的作用[15]。本研究結(jié)果顯示，Cor干預(yù)治療后p-Nrf2/Nrf2、NQO1、HO-1的表達(dá)升高，提示Cor對老年大鼠心臟功能具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)Nrf2/HO-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，Cor能夠改善老年大鼠心臟功能，緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，對大鼠心臟組織損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)Nrf2/HO-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。