王坤男，張錦明，張 蕓，張鈞則，袁新普，鄒貴軍，張朝軍

在全球范圍內(nèi)，胃癌是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)惡性腫瘤之一[1]。在我國(guó)其發(fā)病率居第二位，是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的重要因素[2]。隨著醫(yī)學(xué)水平不斷發(fā)展已在一定程度上改善了胃癌患者預(yù)后，但晚期胃癌患者尚無(wú)有效治療手段，中位生存期不到12個(gè)月[3-4]。因此，探索胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)胃癌防治至關(guān)重要。

microRNA是真核生物中抑制基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼RNA，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、腫瘤生長(zhǎng)等生物學(xué)功能[5]。有研究[6]證實(shí)大多數(shù)癌癥中存在miRNA異常表達(dá)。相關(guān)研究[7-10]提示miR-3188在多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。該研究通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miR-3188的下游靶基因，通過(guò)使用基因干擾技術(shù)，觀察miR-3188通過(guò)調(diào)控下游靶基因表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移能力的影響，為探究胃癌進(jìn)展機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料胃癌細(xì)胞系HGC-27細(xì)胞、胃黏膜細(xì)胞系GES-1細(xì)胞購(gòu)自廣州賽庫(kù)生物技術(shù)有限公司，胃癌細(xì)胞系MGC-803細(xì)胞購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司，BGC-823細(xì)胞、MKN-45細(xì)胞獲贈(zèng)于陸軍軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)材料學(xué)教研室。DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液購(gòu)自索萊寶科技有限公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Gibco公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒及TRIzol試劑均購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit、定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM、microRNA提取試劑盒Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis and TB Green? qRT-PCR User Manual購(gòu)自Takara公司；miR-3188 mimic、miR-3188 inhibitor、陰性對(duì)照以及pc-control、pc-NRAGE質(zhì)粒均由蘇州吉瑪生物科技有限公司提供，含野生型和突變型NRAGE序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供；細(xì)胞周期蛋白D 1(CyclinD 1)，基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP 9)，B-cell leuke-2蛋白(Bcl-2)，N鈣黏蛋白(N-cadherin)，波形蛋白(Vimentin)，E鈣黏蛋白(E-cadherin)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG二抗及電化學(xué)發(fā)光(ECL)液購(gòu)自江蘇親科生物研究中心有限公司；NRAGE抗體購(gòu)自Abcam公司，雙熒光素酶檢測(cè)報(bào)告試劑盒購(gòu)自美國(guó)Progema公司；Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)Corning公司；RIPA、BCA蛋白定量試劑盒等蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)所需試劑均購(gòu)自北京陽(yáng)光英銳生物有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自北仁化學(xué)科技(北京)有限公司，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Miltenyi Biotec公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組細(xì)胞系HGC-27、MGC-803、BGC-823、MKN-45及GES-1放入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2、相對(duì)濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度到80%左右時(shí)進(jìn)行傳代。將HGC-27細(xì)胞分為陰性對(duì)照組(miR-NC組、antimiR-NC組)：轉(zhuǎn)染對(duì)照模擬物、對(duì)照抑制物；miR-3188上調(diào)組(miR-3188組)：轉(zhuǎn)染miR-3188 mimic；miR-3188下調(diào)組(antimiR-3188組)：轉(zhuǎn)染miR-3188 inhibitor；miR-3188+pc-control組：共同轉(zhuǎn)染miR-3188 mimic與陰性對(duì)照質(zhì)粒；miR-3188+pc-NRAGE組：共同轉(zhuǎn)染miR-3188 mimic與NRAGE過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。將miRNA模擬物NC(miR-NC)、miRNA抑制物NC(antimiR-NC)、miR-3188 mimic、miR-3188 inhibitor、陰性對(duì)照質(zhì)粒(pc-control)、NRAGE過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pc-NRAGE)分別或共同轉(zhuǎn)染至HGC-27細(xì)胞中，嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,首先將細(xì)胞均勻接種至6孔板中，待細(xì)胞匯合度至40%左右時(shí)，使用LipofectamineTM2000試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48～72 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-3188及NRAGE mRNA表達(dá)水平采用TRIzol提取細(xì)胞總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM、Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis and TB Green? qRT-PCR User Manual說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。miR-3188以U6為內(nèi)參基因，NRAGE以GAPDH為內(nèi)參基因，用公式2-ΔΔCt計(jì)算miR-3188和NRAGE mRNA表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.4 生物信息學(xué)分析使用基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站Tar-getScan(www.targetscan.org)預(yù)測(cè)miR-3188的下游靶基因，從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cancergenome.

nih.gov)下載胃癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)并分析miR-3188與所預(yù)測(cè)靶基因表達(dá)的相關(guān)性。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)利用生物信息分析數(shù)據(jù)庫(kù)(TargetScan)預(yù)測(cè)NRAGE mRNA的3′UTR存在miR-3188的結(jié)合位點(diǎn)，分別構(gòu)建重組熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-NRAGE-3′UTR(WT-NRAGE)及突變熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-NRAGE-3′UTR(MUT-NRAGE)，按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明將WT-NRAGE和MUT-NRAGE轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，同時(shí)將miR-control或miR-3188 mimic轉(zhuǎn)入各組細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后按照熒光素酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。

1.6 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HGC-27細(xì)胞中NRAGE、CyclinD 1、Bcl-2、MMP 9及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入RIPA裂解液，經(jīng)12 000 r/min離心10 min后吸取上清液，測(cè)定蛋白濃度后各蛋白樣品分別加入5倍上樣緩沖液，金屬浴變性5 min。取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)(80 V 20 min；120 V 90 min)，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將PVDF膜剪裁為合適大小，室溫下用5% 脫脂奶粉封閉2 h，加入各蛋白一抗(除GAPDH稀釋比例為1 ∶5 000外，其余蛋白一抗稀釋比例均為1 ∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，5 min/次，加入二抗(稀釋比例1 ∶8 000)于室溫條件下孵育1 h，TBST洗滌3次，5 min/次，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行曝光拍照。

1.7 CCK-8法檢測(cè)HGC-27細(xì)胞增殖率將各組細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后重新調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml，以5 000個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種至96孔板內(nèi),每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)48、72 h后，每孔加入10 μl CCK-8試劑，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(optical density，OD)值。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況各組細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌、胰蛋白酶消化后重懸調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，收集細(xì)胞后加入1 ml 1×binding Buffer洗滌兩次后，加入5 μl Annexin V-FITC混勻、室溫下避光孵育15 min，使用1 ml 1×Binding Buffer洗滌細(xì)胞，重懸細(xì)胞加入5 μl PI后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

1.9 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HGC-27細(xì)胞侵襲和遷移能力預(yù)備：將基質(zhì)膠至于4 ℃冰箱內(nèi)過(guò)夜解凍，次日使用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基將基質(zhì)膠稀釋至30 mg/ml，取100 μl稀釋液置于Transwell小室上室；細(xì)胞處理：收集各組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HGC-27細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml，取100 μl細(xì)胞懸液置于鋪滿(mǎn)基質(zhì)膠的Transwell小室的上室；恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后用沾有PBS的棉簽除去基質(zhì)膠及Transwell小室的上室細(xì)胞，用多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫溶液染色20 min，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：除去制備基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)步驟外，其余實(shí)驗(yàn)步驟均與細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及制圖。本研究統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，雙連續(xù)變量相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時(shí)，說(shuō)明數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃黏膜細(xì)胞及胃癌細(xì)胞中miR-3188的表達(dá)水平qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-3188在 HGC-27、MGC-803、BGC-823、MKN-45 中的相對(duì)表達(dá)量低于 GES-1，其中 HGC-27 細(xì)胞中 miR-3188 相對(duì)表達(dá)量最低，選擇 HGC-27 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，胃黏膜膜細(xì)胞同胃癌細(xì)胞系中的miR-3188相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=362，P<0.001)，見(jiàn)圖1。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)正常胃黏膜細(xì)胞及胃癌細(xì)胞系中miR-3188表達(dá)與正常胃黏膜細(xì)胞GES-1比較：***P<0.001

2.2 miR-3188靶向調(diào)控胃癌細(xì)胞中NRAGE的表達(dá)生物信息分析數(shù)據(jù)庫(kù)(TargetScan)預(yù)測(cè)NRAGE可能是miR-3188的靶基因，使用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，Spearman相關(guān)分析提示在胃癌中NRAGE的表達(dá)量與miR-3188表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(rho=-0.22，P<0.05)，見(jiàn)圖2A。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，在WT-NRAGE轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，與miR-control轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比較，miR-3188 mimic 轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞熒光素酶活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.791，P<0.01)，共轉(zhuǎn)染MUT-NRAGE與miR-3188 mimic的細(xì)胞熒光素酶活性未見(jiàn)改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.388，P>0.05)，見(jiàn)圖2B。Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-3188 mimic、miR-3188 inhibitor及其陰性對(duì)照物miR-NC、antimiR-NC的HGC-27細(xì)胞中NRAGE蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-3188 mimic的HGC-27細(xì)胞中miR-3188組NRAGE蛋白表達(dá)水平低于miR-NC組，而轉(zhuǎn)染miR-3188 inhibitor的HGC-27細(xì)胞中antimiR-3188組NRAGE蛋白表達(dá)水平高于antimiR-NC組。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，各組NRAGE mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.08，P>0.05)，見(jiàn)圖3。

圖2 miR-3188在HGC-27細(xì)胞中與NRAGE 3的靶向關(guān)系A(chǔ)：生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miR-3188與NRAGE 3′UTR的結(jié)合位點(diǎn)及在胃癌組織中miR-3188與NRAGE表達(dá)水平的相關(guān)性；B：雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-3188的靶基因；與WT-NRAGE+miR-control比較：**P<0.01

圖3 miR-3188對(duì)HGC-27細(xì)胞NRAGE蛋白及mRNA表達(dá)水平的影響A：miR-NC組；B：miR-3188組；C：antimiR-NC組；D:antimiR-3188組

2.3 miR-3188通過(guò)調(diào)控NRAGE表達(dá)抑制HGC-27細(xì)胞增殖CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h時(shí)，同miR-NC組相比，miR-3188組細(xì)胞增殖率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.504，P<0.001)，而miR-3188 mimic+pc-NRAGE組的細(xì)胞增殖率高于miR-3188 mimic+pc-control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.630，P<0.001)；轉(zhuǎn)染72 h時(shí)，同miR-NC組相比，miR-3188 mimic組細(xì)胞增殖率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.301，P<0.001)，而miR-3188 mimic+pc-NRAGE組的細(xì)胞增殖率高于miR-3188 mimic+pc-control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.125，P<0.001)，見(jiàn)圖4。

圖4 miR-3188靶向NRAGE對(duì)HGC-27細(xì)胞增殖的影響與miR-NC組比較：***P<0.001；與miR-3188+pc-control組比較：###P<0.001；A:miR-NC組；B:miR-3188組；C:miR-3188+pc-control組；D:miR-3188+pc-NRAGE組

2.4 miR-3188通過(guò)調(diào)控NRAGE表達(dá)促進(jìn)HGC-27細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，同miR-NC組相比，miR-3188組的細(xì)胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.735，P<0.001)，而miR-3188+pc-NRAGE組細(xì)胞凋亡率低于miR-3188+pc-control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.96，P<0.01)，見(jiàn)圖5。

圖5 miR-3188靶向NRAGE對(duì)HGC-27細(xì)胞凋亡的影響A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率變化；B：與miR-NC組比較：***P<0.001；與miR-3188+pc-control組比較：##P<0.01；a：miR-NC組；b：miR-3188組；c：miR-3188+pc-control組；d：miR-3188+pc-NRAGE組

2.5 miR-3188通過(guò)調(diào)控NRAGE表達(dá)抑制HGC-27細(xì)胞侵襲及遷移能力Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，同miR-NC組相比，miR-3188組各視野下的細(xì)胞侵襲數(shù)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.760，P<0.01)，各視野下的細(xì)胞遷移數(shù)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.590，P<0.01)；同miR-3188+pc-control相比，miR-3188+pc-NRAGE組各視野下細(xì)胞侵襲數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.151，P<0.01)，各視野下細(xì)胞遷移數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.361，P<0.01)，見(jiàn)圖6。

圖6 miR-3188靶向NRAGE對(duì)HGC-27細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響 ×200與miR-NC組比較：**P<0.01；與miR-3188+pc-control組比較：##P<0.01

2.6 miR-3188通過(guò)調(diào)控NRAGE表達(dá)抑制HGC-27細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，miR-3188組的N-cadherin、Vimentin、CyclinD 1、Bcl-2、MMP 9蛋白表達(dá)水平低于miR-NC組，而miR-3188+pc-NRAGE組N-cadherin、Vimentin、CyclinD 1、Bcl-2、MMP 9的表達(dá)水平高于miR-3188+pc-control組，同時(shí)miR-3188組E-cadherin蛋白表達(dá)水平高于miR-NC組，而miR-3188+pc-NRAGE組E-cadherin蛋白表達(dá)水平低于miR-3188 mimic+pc-control組，見(jiàn)圖7。

圖7 miR-3188靶向調(diào)控NRAGE對(duì)HGC-27細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移、EMT相關(guān)蛋白表達(dá)影響A：miR-NC組；B：miR-3188組；C：miR-3188+pc-control組；D：miR-3188+pc-NRAGE組

3 討論

胃癌是當(dāng)前威脅人類(lèi)生命健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，探索胃癌的發(fā)病機(jī)制及尋找潛在治療靶點(diǎn)仍是需要解決的重要難題。大量研究已經(jīng)證實(shí)miRNA在眾多癌癥當(dāng)中存在異常表達(dá)，其在癌癥的診斷及治療方面的價(jià)值不言而喻，同時(shí)越來(lái)越多的研究亦表明miRNA密切參與調(diào)控胃癌的發(fā)展過(guò)程。例如，miR-505可通過(guò)靶向調(diào)控HMGB 1抑制胃癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡[11]。相反，miR-532可靶向調(diào)控NKD 1促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲[12]。miRNA在胃癌發(fā)展過(guò)程中可扮演多種角色并發(fā)揮重要作用，因此研究miRNA對(duì)胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響對(duì)探索胃癌發(fā)病機(jī)制及發(fā)展過(guò)程具有重要意義。

有研究[7]證實(shí)miR-3188在不同癌癥當(dāng)中發(fā)揮重要作用，例如在鼻咽癌中，miR-3188可作為腫瘤抑制因子直接靶向mTOR參與FOXO 1介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，腫瘤發(fā)生和鼻咽癌化療耐藥。miR-3188在頭頸部癌(HNC)細(xì)胞系、組織來(lái)源的外泌體及其親本癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)中低表達(dá)，外泌體內(nèi)的miR-3188可通過(guò)靶向Bcl-2影響HNC細(xì)胞的增殖和凋亡[8]。miR-3188在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞中通過(guò)mTOR/PI3K/AKT/c-jun信號(hào)通路與FOXO 1相互作用從而抑制NSCLC細(xì)胞增殖[9]。相反，miR-3188在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并可通過(guò)抑制p 27促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖[10]。本研究結(jié)果顯示miR-3188在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)量低于正常胃黏膜細(xì)胞，通過(guò)在胃癌細(xì)胞HGC-27中轉(zhuǎn)染miR-3188 mimic，并進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在胃癌細(xì)胞HGC-27中過(guò)表達(dá)miR-3188能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移并促進(jìn)其發(fā)生凋亡，miR-3188可能在胃癌發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮抑癌作用。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)NRAGE可能是miR-3188的靶基因，有研究[13]表明，在胃癌組織中NRAGE表達(dá)上調(diào)與TNM分期、局部浸潤(rùn)和預(yù)后不良相關(guān)。此外，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在WT-NRAGE轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，miR-3188過(guò)表達(dá)降低熒光素酶活性，而在MUT-NRAGE轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，則未見(jiàn)熒光素酶活性降低，該結(jié)果顯示NRAGE是miR-3188的靶基因。通過(guò)在胃癌細(xì)胞HGC-27中分別轉(zhuǎn)染miR-3188 mimic及miR-3188 inhibitor，Western blot及qRT-PCR結(jié)果顯示miR-3188可負(fù)向調(diào)控NRAGE蛋白表達(dá)，但不影響其mRNA表達(dá)水平。為進(jìn)一步探究胃癌細(xì)胞中miR-3188是否通過(guò)調(diào)控NRAGE發(fā)揮抑癌作用，將pc-control及pc-NRAGE分別轉(zhuǎn)染至miR-3188過(guò)表達(dá)的HGC-27細(xì)胞中，CCK-8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pc-NRAGE可逆轉(zhuǎn)miR-3188對(duì)胃癌細(xì)胞HGC-27增殖、侵襲及遷移能力的抑制作用，并減少細(xì)胞凋亡。CyclinD 1、Bcl-2、MMP 9分別是細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移生物學(xué)行為的重要標(biāo)志蛋白[14-15]。Western blot結(jié)果提示miR-3188/NRAGE軸可能通過(guò)干擾上述蛋白表達(dá)而抑制胃癌細(xì)胞發(fā)展。EMT機(jī)制在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等蛋白是EMT的標(biāo)志蛋白[15]。本研究結(jié)果顯示胃癌細(xì)胞HGC-27中miR-3188過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制NRAGE表達(dá)導(dǎo)致N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)下調(diào)同時(shí)促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá)。這一結(jié)果提示在胃癌細(xì)胞HGC-27中，miR-3188可能通過(guò)靶向調(diào)控NRAGE抑制EMT進(jìn)程。

綜上所述，miR-3188過(guò)表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，其作用機(jī)制可能與通過(guò)靶向調(diào)控NRAGE的表達(dá)有關(guān)，該研究結(jié)果為探索胃癌發(fā)展機(jī)制及找尋新的胃癌治療靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。