張紅霞，吳廣勝

慢性粒細(xì)胞性白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一種骨髓增生性腫瘤，酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKI)作為CML治療的臨床一線用藥，仍有許多患者對(duì)TKIs發(fā)生耐藥[1]。CML與Wnt、Notch、Hippo等信號(hào)通路的失調(diào)相關(guān)[2]。轉(zhuǎn)錄共激活因子Yes相關(guān)蛋白1(Yes-associated protein 1, YAP1)是Hippo信號(hào)通路中的癌基因，在腫瘤發(fā)生中起著重要的作用[3]。YAP參與了癌癥惡性行為的維持[4-6]，有研究[7]顯示抑制YAP的表達(dá)，CML細(xì)胞生長(zhǎng)減慢增加藥物的敏感性，另有研究[8]表明YAP的磷酸化水平與CML細(xì)胞生長(zhǎng)成正比。

近年來(lái)微小RNA(microRNA，miRNA)在調(diào)控基因表達(dá)、腫瘤發(fā)生及發(fā)展發(fā)揮了重要作用[9]。miR-1285，也稱為miR-1285-1，miR-1285-3p，位于7q21-q22中[10]。miR-1285在多種癌癥中發(fā)揮抑癌作用[11]，而在CML中的作用尚不清楚。CML中許多microRNA處于失衡狀態(tài)，多項(xiàng)研究[12]證明這些microRNA在調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮了重要作用，但是否會(huì)作用于YAP這條通路尚無(wú)有力證據(jù)。因此該研究主要側(cè)重于miR-1285通過(guò)靶向YAP對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞的增殖、凋亡以及對(duì)其作用機(jī)制的初步探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒(Thermo Fisher公司)，CCK8檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Abcam公司)，RIPA細(xì)胞裂液(BOSTER公司)，1%青鏈霉素、10%胎牛血清(Gibco公司)，質(zhì)粒(上海Genepharma公司)，具體序列見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)粒序列

1.2 K562細(xì)胞的制備慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞購(gòu)于武漢普諾賽公司，使用含1%青鏈霉素10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 ℃含有5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h進(jìn)行更換培養(yǎng)基處理并1 ∶2傳代。選擇對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染使用Lippofectamine 3000作為載體。

1.3 CCK-8法檢測(cè)K562細(xì)胞增殖情況按5×105/ml密度將K562細(xì)胞種植在24孔板中并設(shè)置空白組，培養(yǎng)12 h后，每組設(shè)置3個(gè)對(duì)照組，將質(zhì)粒與K562細(xì)胞共培養(yǎng)48 h與72 h后，每孔加入25 μl CCK-8試劑，避光，37 ℃條件中孵育1.5 h，測(cè)定酶標(biāo)儀在450 nm吸光度時(shí)的吸光度(A)值，以此來(lái)計(jì)算細(xì)胞的增殖率。計(jì)算方法：增殖率=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)K562細(xì)胞凋亡情況按5×105/ml密度將K562細(xì)胞種植在6孔板中，按照1.3項(xiàng)處理后的K562細(xì)胞使用預(yù)冷的PBS沖洗干凈后，加入胰酶消化后收集細(xì)胞，離心獲得沉淀，使用PBS重懸細(xì)胞后分裝，分別加入PI和Annexin V-FITC抗體后，設(shè)置對(duì)照組，避光情況下上機(jī)檢測(cè)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)K562細(xì)胞中miR-1285的表達(dá)水平按照1.3項(xiàng)處理后的K562細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞中總RNA，調(diào)平后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件：37 ℃ 2 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，4 ℃ 保存。將所得cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，所用PCR引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增條件為:95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)次數(shù)40次。使用2-ΔΔCt計(jì)算公式得出mRNA的表達(dá)量。

1.6 Western blot法測(cè)定蛋白表達(dá)量按照1.3項(xiàng)處理后的K562細(xì)胞加入RIPA細(xì)胞裂解液，獲取K562細(xì)胞中總蛋白樣品，用BCA法檢測(cè)上樣蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度后使各組濃度一致，然后使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入兔抗鼠單克隆抗體YAP、P-EGFR、EGFR、BAX、Bcl-2、GAPDH(稀釋比1 ∶800)于4 ℃條件下孵育24 h后，充分去除一抗并于常溫條件下加入山羊抗兔二抗(稀釋比1 ∶20 000)孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)各分子的蛋白表達(dá)情況，使用Image J軟件處理灰度值并計(jì)算相對(duì)蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后K562細(xì)胞內(nèi)miR-1285 mRNA的表達(dá)量在轉(zhuǎn)染后48 h檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-1285的表達(dá)量，與mimics control組比較，miR-1285 mimics組表達(dá)升高，與inhibitor control組比較，miR-1285 inhibitor組表達(dá)下降(P<0.05)。而mimics control組與inhibitor control組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 不同處理組miR-1285表達(dá)情況A：mimics組；B：mimics control組；C：inhibitor組；D：inhibitor control組；與mimics control組比較：*P<0.05；與inhibitor control組比較：#P<0.05

2.2 過(guò)表達(dá)miR-1285后抑制K562細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48 h，與miR-1285 inhibitor組比較，miR-1285 inhibitor組、mimics control組、inhibitor control組均可促進(jìn)K562細(xì)胞增殖(P<0.05)；而通過(guò)過(guò)表達(dá)miR-1285，miR-1285 mimics組較mimics control組增殖減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在相同的培養(yǎng)環(huán)境下，miR-1285 inhibitor組細(xì)胞增殖明顯高于inhibitor control組(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 不同處理組K562細(xì)胞增殖情況A：mimics組；B：mimics control組；C：inhibitor組；D：inhibitor control組；與mimics control組比較：*P<0.05；與inhibitor control組比較：#P<0.05

圖3 不同處理組K562細(xì)胞凋亡情況A：mimics組；B：mimics control組；C：inhibitor組；D：inhibitor control組；與mimics control組比較：*P<0.05；與inhibitor control組比較：#P<0.05

2.4 凋亡相關(guān)分子BAX、Bcl-2的蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，與mimics control組比較，mimics組BAX升高，而B(niǎo)cl-2降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與inhibitor control組比較，miR-1285 inhibitor組的BAX表達(dá)降低，而B(niǎo)cl-2表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 不同處理組K562凋亡相關(guān)蛋白BAX、Bcl-2表達(dá)情況A：mimics組；B：mimics control組；C：inhibitor組；D：inhibitor control組；與mimics control組比較：*P<0.05；與inhibitor control組比較：#P<0.05

2.5 YAP及EGFR下游相關(guān)分子的蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-1285后，YAP的表達(dá)下降，而敲低miR-1285會(huì)使YAP的表達(dá)上升；與mimics control組比較，miR-1285 mimics組的YAP、P-EGFR表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與inhibitor control組比較，miR-1285 inhibitor組的YAP、P-EGFR表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組之間EGFR未見(jiàn)明顯變化，見(jiàn)圖5。

圖5 不同處理組K562細(xì)胞中YAP、EGFR、P-EGFR的表達(dá)情況A：mimics組；B：mimics control組；C：inhibitor組；D：inhibitor control組；與mimics control組比較：*P<0.05；與inhibitor control組比較：#P<0.05

3 討論

近年來(lái)關(guān)于microRNA的研究逐漸增多，其中在抑制腫瘤方面有較多發(fā)現(xiàn)。有研究[13]顯示在CML中使用YAP抑制劑維替泊芬可抑制其凋亡，促進(jìn)增殖。本研究顯示使用miR-1285質(zhì)粒后，使miR-1285表達(dá)增加時(shí)，K562細(xì)胞增殖減弱，而凋亡增加；相同條件下使miR-1285下調(diào)后，K562細(xì)胞出現(xiàn)增殖明顯而抑制凋亡。這與Huang et al[14]在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)miR-1285過(guò)表達(dá)后其抑制惡性生物學(xué)行為，可能是抑制了YAP的表達(dá)；而使miR-1285降低時(shí)，可得到相反的結(jié)果。

通過(guò)過(guò)表達(dá)或敲低miR-1285，可以觀察到K562細(xì)胞中miR-1285表達(dá)升高及降低，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,證明可有效建立細(xì)胞模型。當(dāng)過(guò)表達(dá)miR-1285后，與inhibitor組相比，K562細(xì)胞凋亡增加，而使miR-1285表達(dá)降低時(shí)，細(xì)胞凋亡降低，可能是由于過(guò)表達(dá)miR-1285后可抑制YAP的表達(dá)從而使K562細(xì)胞增殖減弱，進(jìn)而凋亡增加，當(dāng)使miR-1285表達(dá)降低后對(duì)YAP的抑制作用減弱，YAP表達(dá)增加，促進(jìn)K562細(xì)胞的增殖，抑制凋亡。這與相關(guān)研究[13]結(jié)果一致。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-1285后，K562細(xì)胞增殖減弱，而敲低miR-1285后，可促進(jìn)miR-1285的增殖，增殖結(jié)果與流式結(jié)果相一致；其原因也與上述一致，可能是由于抑制或促進(jìn)YAP的表達(dá)進(jìn)而影響了K562細(xì)胞的增殖。

對(duì)凋亡相關(guān)分子BAX與Bcl-2進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示mimics組BAX表達(dá)量升高，且明顯高于其余三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)抑制miR-1285后，BAX的表達(dá)量較對(duì)照組下降，明顯低于mimics組；而與之對(duì)應(yīng)的促增殖因子Bcl-2在mimics組中表達(dá)明顯低于三組，而在inhibitor組中Bcl-2表達(dá)高于其余三組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；說(shuō)明miR-1286可通過(guò)一系列信號(hào)通路作用于K562細(xì)胞的線粒體通路從而影響增殖與凋亡，過(guò)表達(dá)miR-1285后，細(xì)胞增殖能力減弱，可能是因?yàn)橐种屏薆cl-2而促進(jìn)BAX的表達(dá)，通過(guò)線粒體通路來(lái)影響細(xì)胞增殖情況。而敲低miR-1285后，這種抑制作用減弱，對(duì)線粒體凋亡通路影響較小，因此促進(jìn)細(xì)胞增殖。然而這種是通過(guò)何種機(jī)制來(lái)發(fā)揮作用的不得而知。

有研究[15]顯示miR-1285可通過(guò)YAP信號(hào)通路可調(diào)控卵巢癌的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。而另有一項(xiàng)研究[7]證明YAP抑制劑可作用于K562細(xì)胞介導(dǎo)Hippo信號(hào)通路抑制增殖、促進(jìn)凋亡。miRNA在CML中的研究較少，但YAP對(duì)CML的作用已有大量研究[16]證實(shí)，因此筆者猜想miR-1285是否也能作用于YAP進(jìn)而影響K562細(xì)胞的生物學(xué)行為，對(duì)增殖、凋亡有何影響。本研究結(jié)果顯示使miR-1285過(guò)表達(dá)后可抑制YAP的表達(dá)，通過(guò)對(duì)下游分子檢測(cè)P-EGFR表達(dá)也下降，而非磷酸化的EGFR未見(jiàn)明顯變化；當(dāng)使miR-1285敲低后，這種抑制作用會(huì)減弱，相比對(duì)照組YAP的表達(dá)升高，下游分子P-EGFR的表達(dá)隨之升高，而相應(yīng)的非磷酸化EGFR表達(dá)不變，發(fā)生這種情況的原因可能是由于miR-1285作用于YAP使表達(dá)降低，進(jìn)而抑制對(duì)下游分子的激活作用，使下游分子呈現(xiàn)出非磷酸化，而使miR-1285表達(dá)降低后，這種抑制作用會(huì)降低，影響其他分子對(duì)YAP的抑制作用，使YAP表達(dá)升高，再通過(guò)一系列信號(hào)通路影響K562細(xì)胞的線粒體凋亡通路，抑制BAX的表達(dá)，使Bcl-2的表達(dá)升高，促進(jìn)增殖，抑制凋亡。

綜上所述，YAP的表達(dá)異常參與了多種腫瘤細(xì)胞及血液系統(tǒng)疾病的生物學(xué)行為進(jìn)程，與疾病的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸均密切相關(guān)。miR-1285又可以通過(guò)作用于YAP使YAP表達(dá)異常，在CML細(xì)胞的增殖、凋亡方面發(fā)揮了重要作用。為后期研究microRNA在CML的作用機(jī)制提供思路，為后期靶向治療提供新方向，可設(shè)計(jì)針對(duì)于CML的microRNA，為該病后期治療提供一種新的靶向藥物。