楊 霞，董文杰，高 芳，武金寶，馬立聰，黨 彤，孟憲梅，賈彥彬,,4

近年來，有研究[1-2]表明一些疾病的發(fā)生發(fā)展與個(gè)體的遺傳易感性密切相關(guān)。一些單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)可以作為胃癌篩查的重要遺傳標(biāo)志物以及防治的重要靶點(diǎn)。殘留樣蛋白質(zhì)家族成員4 (vestigial like family member 4，VGLL4)在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，VGLL4是研究胃癌變的重要候選基因[3-5]。然而，目前關(guān)于VGLL4基因多態(tài)性與胃癌的關(guān)系還未見有報(bào)道。因此，該研究在包頭漢族人群中分析了VGLL4基因多態(tài)性與非賁門胃癌遺傳易感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取 2008 年至2020 年包頭市腫瘤醫(yī)院經(jīng)組織病理學(xué)診斷為非賁門胃癌的 450 例患者為病例組。所有患者均排除繼發(fā)病例和復(fù)發(fā)病例，且未接受過手術(shù)治療及放、化療。其中男性 336 例，女性 114 例，年齡 26～83 歲，平均年齡為(60.76±10.64)歲。450例正常對(duì)照來自同期社區(qū)體檢人群，均排除癌癥病史和明顯的胃部疾病史，且排除遺傳病史。其中男性 336 例，女性 114 例，年齡 26～93歲，平均年齡為(59.66±11.43)歲；病例組和對(duì)照組在年齡和性別方面相匹配(年齡：t=-1.489，P=0.137；性別：χ2=0，P=1.000)。900 例研究樣本均為在包頭地區(qū)居住 5 年以上的漢族人群，相互之間無血緣關(guān)系。所有納入研究的對(duì)象均簽署了知情同意書，本研究已獲得包頭醫(yī)學(xué)院倫理學(xué)委員會(huì)的批準(zhǔn)[包醫(yī)倫審人體2021第(006)號(hào)]。

1.2 方法

1.2.1SNPs的篩選 在HapMap 數(shù)據(jù)庫( http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov)中篩選VGLL4的標(biāo)記單核苷酸多態(tài)性(Tag-SNPs)。要求SNP在中國漢族人群中最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)>5%，連鎖不平衡值r2>0.8，在篩選出的Tag-SNPs中優(yōu)先選擇文獻(xiàn)報(bào)道的可能和疾病關(guān)聯(lián)的SNPs進(jìn)行初步研究。最終選擇了 SNP rs1803489、rs7617620、rs13078528 進(jìn)行研究。

1.2.2基因分型 對(duì)研究對(duì)象靜脈采血2 ml，用EDTA-K2抗凝。靜脈血液離心后分層，將血漿和血細(xì)胞分離分裝，并分別編號(hào)置于-20 ℃醫(yī)用冰箱保存?zhèn)溆?。用人血液基因組 DNA 提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取外周血白細(xì)胞中的人基因組DNA。用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)好的引物送北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系共25 μl，包含DNA 50 ng、2×Taq Master Mix 12.5 μl、上下游引物(10 μmol/L)各1 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。具體引物序列及PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。PCR產(chǎn)物用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，內(nèi)切酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。酶切反應(yīng)體系共10 μl，包含PCR產(chǎn)物3 μl、10×NE Buffer 1 μl、限制性內(nèi)切酶5 U，并置于內(nèi)切酶最適反應(yīng)溫度下作用60 min。對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行2 %瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)片段大小判斷基因型。具體內(nèi)切酶及相應(yīng)的反應(yīng)溫度和酶切片段長(zhǎng)度見表1。

表1 PCR引物序列和長(zhǎng)度及酶切反應(yīng)條件

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 17. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在對(duì)照組中用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)來檢測(cè)VGLL4基因各SNP位點(diǎn)的基因型分布是否符合Hardy-Weniberg平衡，以驗(yàn)證研究樣本在包頭地區(qū)漢族人群中是否具有群體代表性和可比性，若P>0.05則表示各位點(diǎn)的基因型分布符合Hardy-Weniberg平衡。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較分析年齡在病例組和對(duì)照組間的分布差異; 采用χ2檢驗(yàn)比較性別在病例組和對(duì)照組的分布差異。在共顯性、顯性、隱性、超顯性4種遺傳模式下評(píng)估各SNP位點(diǎn)非賁門胃癌的關(guān)系。用非條件性Logistic回歸計(jì)算出比值比(odds ratio，OR)和95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)，OR和95%CI經(jīng)年齡、性別調(diào)整。采用Haploview 4.2軟件對(duì)VGLL4基因各SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)進(jìn)行分析并構(gòu)建單體型，構(gòu)建的單體型與非賁門胃癌的關(guān)聯(lián)性采用多重Logistic回歸進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 各SNP位點(diǎn)在不同遺傳模型下與非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系對(duì)照組中VGLL4基因SNP rs1803489、rs7617620、rs13078528 位點(diǎn)的基因型頻數(shù)分布符合Hardy-Weniberg平衡(rs1803489：χ2=0.117，P=0.943；rs7617620：χ2=5.374，P=0.068；rs13078528：χ2=1.200，P=0.549)。

在共顯性、顯性、隱性和超顯性4種遺傳模型下，分析VGLL4基因各SNP位點(diǎn)與非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。結(jié)果顯示 SNP rs1803489在共顯性、顯性和超顯性模型中均與非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)，其中共顯性模型為最佳遺傳模型，其最小信息準(zhǔn)則(akaike information criterion，AIC)和貝葉斯信息準(zhǔn)則(bayesian information criterion，BIC)值最小。與攜帶GG基因型相比，攜帶AG基因型者非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加(AGvsGG，OR=1.511，95%CI=1.095～2.085)。SNP rs7617620、rs13078528 與非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)均沒有關(guān)聯(lián)(P>0.05)。見表 2。

表2 SNP與非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)[n(%)]

2.2VGLL4基因單體型與非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系對(duì)VGLL4基因的3個(gè)SNP進(jìn)行連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)：rs1803489、rs7617620、rs13078528三個(gè)位點(diǎn)連鎖程度低，未能構(gòu)建出單體型塊。

3 討論

VGLL4基因位于染色體3p25.3-3p25.2，包含14個(gè)外顯子，編碼VGLL4。VGLL4的羧基末端有兩個(gè)TDU結(jié)構(gòu)域，可以與轉(zhuǎn)錄因子TEA域蛋白質(zhì)家族成員(TEA domain family members，TEADs)結(jié)合并執(zhí)行抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和進(jìn)展的功能[6]。

Hippo信號(hào)通路是一條腫瘤抑制通路，轉(zhuǎn)錄共激活因子Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)作為其下游至關(guān)重要的效應(yīng)因子可以與TEADs結(jié)合，并激活其靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而驅(qū)動(dòng)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、侵襲。在多種人類消化系統(tǒng)腫瘤包括胃癌、結(jié)腸直腸癌和肝癌等的研究中發(fā)現(xiàn)YAP與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3,7-8]。然而，VGLL4可以通過其TDU結(jié)構(gòu)域競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TEADs并抑制YAP和TEADs之間的相互作用，從而抑制癌基因的表達(dá)[9]。

目前，關(guān)于VGLL4與胃癌的相關(guān)性研究較多。在人胃癌中，VGLL4在腫瘤組織中的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著低于正常組織和腫瘤周圍組織[3-4]。VGLL4mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與腫瘤大小、腫瘤分期、漿膜浸潤、淋巴管侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)[3,5]。同時(shí)，VGLL4的表達(dá)水平與胃癌患者的5年存活率呈負(fù)相關(guān)，是胃癌的預(yù)后標(biāo)志物[5]。綜上所述，VGLL4蛋白在胃癌組織中低表達(dá)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、侵襲性和5年生存率等臨床病理特征存在相關(guān)性，是人類胃癌的潛在腫瘤抑制因子。同時(shí)，研究也提示VGLL4基因是研究胃癌變的重要候選基因之一。因此，本研究在包頭地區(qū)漢族人群中檢測(cè)了VGLL4的基因多態(tài)性與非賁門胃癌遺傳易感性的關(guān)系，為胃癌變的篩查、診斷和防治提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

本研究顯示，在包頭漢族人群中VGLL4基因SNP rs1803489與非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)。在共顯性模型中，與GG基因型攜帶者相比，AG基因型攜帶者非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加(OR=1.511，95%CI=1.095～2.085)；在顯性模型中與GG基因型攜帶者相比，AG+AA基因型攜帶者非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加(OR=1.491，95%CI=1.086～2.047)；在超顯性模型中，與GG+AA基因型攜帶者相比，AG基因型攜帶者非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加(OR=1.510，95%CI=1.094～2.082)；其中共顯性模型為最佳模型，其AIC和BIC值最小，因此AG基因型可能是包頭漢族人群非賁門胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果和VGLL4SNP rs1803489與肺癌遺傳易感性研究[10]的結(jié)果一致，提示rs1803489可能是VGLL4在肺癌、胃癌等癌癥發(fā)生的共同作用通路上的遺傳標(biāo)記，AG基因型是發(fā)病的危險(xiǎn)因素。SNP rs13078528在一項(xiàng)meta分析研究中被鑒定為與成人身高相關(guān)的突變[11]；SNP rs7617620在全基因組關(guān)聯(lián)研究分析中與合并尼古丁依賴和嚴(yán)重抑郁癥相關(guān)聯(lián)[12]。本研究結(jié)果顯示SNP rs13078528、rs7617620與非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)沒有關(guān)聯(lián)，說明SNP rs13078528、rs7617620可能在非賁門胃癌的發(fā)病中不起主要作用。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果有差異，提示相同的SNP在不同的疾病中所起的作用可能不同。然而，由于本研究的樣本量偏低，還需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究，以明確SNP rs1803489、rs13078528、rs7617620與非賁門胃癌遺傳易感性的確切關(guān)系。