艾克熱木江·木合熱木 阿不都乃比·艾力 馬賽

周圍神經(jīng)損傷是創(chuàng)傷骨科常見疾病，約5%創(chuàng)傷患者伴有周圍神經(jīng)損傷[1-2]。周圍神經(jīng)損傷導(dǎo)致的肢體功能缺損會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活能力和工作能力，給患者及其家庭帶來巨大的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)一直是外科醫(yī)生面臨的挑戰(zhàn)。目前治療長段神經(jīng)缺損的金標(biāo)準(zhǔn)是自體神經(jīng)移植。然而，由于該手術(shù)時(shí)間長，同時(shí)存在供體有限與可能導(dǎo)致供區(qū)并發(fā)癥等缺陷，其應(yīng)用受到限制。隨著生物可降解材料相關(guān)研究的發(fā)展與進(jìn)步，各種神經(jīng)導(dǎo)管已可用于神經(jīng)缺損的橋接。但是，神經(jīng)導(dǎo)管在神經(jīng)損傷后支持軸突再生方面的潛力有限，大多數(shù)中空導(dǎo)管只能在很短的距離內(nèi)支持軸突再生[4-5]。近年研究結(jié)果表明，神經(jīng)損傷觸發(fā)的細(xì)胞反應(yīng)受到多種微RNA相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控[6]。微RNA是一種長度為22～23個(gè)核苷酸的單鏈內(nèi)源性非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)真核基因表達(dá)，在細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖、凋亡和癌變等多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用，被認(rèn)為是多種藥物干預(yù)的潛在靶點(diǎn)[7-10]。本研究利用大鼠模型研究微RNA-21對(duì)坐骨神經(jīng)再生的促進(jìn)作用，以驗(yàn)證微RNA-21可能加速軸突再生，促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后功能恢復(fù)這一假說。

資料與方法

一、資料

依據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/)中檢索到的大鼠微RNA-21前體序列(UGUACCACCUUGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACAGCAGUCGAUGGGCUGUCUGACAUUUUGGUAUC)，購買具有以下微RNA序列的試劑：Rat-mir-21-sense：5-TGTACCACCTTGGGGTACTTATCAGACTGATGTGTGTGTGTGATCTCATGGCAAGAGAGAGAGTCGATGTGTCTGTCTGTTTTTGT-3，Anti-sense:5-CTAGACAAAAAAGATACCAATGTCAGACACCATCGACTGCTGTTGCCATGAGATTCAAGTCACAGTCATCGATAAGCTACCACAGCAAGAGTGTACA-3(上海三工生物科技有限公司，中國)。選取6～8周齡雄性Sprague-Dawley大鼠50只(由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量(220.3±20.5)(200～250)g。依據(jù)動(dòng)物模型的治療方法將大鼠隨機(jī)分為3組：微RNA-21組20只大鼠，體質(zhì)量(223.5±18.7 g)(200～250)g；綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)組20只大鼠，體質(zhì)量(220.3±21.6)(200～250)g；正常組10只大鼠，體質(zhì)量(215.0±21.6 )(200～250)g。購買膠原導(dǎo)管(北京天心府醫(yī)療器械有限公司，中國)若干。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

二、方法

1. 含有微RNA-21編碼序列載體的制備：(1)將微RNA-21序列克隆到質(zhì)粒載體：編碼微RNA-21的質(zhì)粒通過由40 μl核酸酶游離水、20 μl DNA寡核苷酸退火緩沖液(5×)、20 μl DNA寡核苷酸(50 μmol)和20 μl反義DNA寡核苷酸(50 μmol)組成的緩沖液構(gòu)建。其構(gòu)建的熱循環(huán)條件為：95 ℃下2 min，降溫速度為1 ℃/90 s，直至溫度降到25 ℃后保存于4 ℃。將293T細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司，美國)中培養(yǎng)。293T細(xì)胞在濃度為80%時(shí)被H1和輔助質(zhì)粒Pcmv delta R8.9轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)3 d后，收集293T細(xì)胞并進(jìn)行病毒純化。通過超速離心濃縮載體，并使用滴度為(1×109)IU/ml的載體進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：術(shù)前采用標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物食物和無限量水飼養(yǎng)大鼠1周。(1)大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型的制作：采用10%水合氯醛麻醉，將大鼠以俯臥位置于手術(shù)臺(tái)上。暴露大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)，對(duì)微RNA-21組和GPE組大鼠以微型剪刀制作6 mm神經(jīng)缺損，并立即使用10 mm長的膠原導(dǎo)管進(jìn)行插管修復(fù)。將神經(jīng)殘端插入導(dǎo)管2 mm，并用9-0微縫線將其縫合到導(dǎo)管上，使近端和遠(yuǎn)端殘端之間保持6 mm距離。對(duì)GPE組大鼠，將3 μl控制載體注射到用于橋接神經(jīng)缺損的神經(jīng)導(dǎo)管中。對(duì)微RNA-21組大鼠，將3 μl含有微RNA-21編碼序列的載體注射到用于橋接神經(jīng)缺損的神經(jīng)導(dǎo)管中。分層縫合關(guān)閉切口。對(duì)正常組大鼠暴露坐骨神經(jīng)后不做處理，直接關(guān)閉切口。術(shù)后在與術(shù)前相同條件下飼養(yǎng)動(dòng)物8周。

3.神經(jīng)再生效果評(píng)價(jià)：(1)坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciatic nerve function index，SFI)評(píng)估：取每組各5只大鼠。將大鼠后腳浸于墨水中，使大鼠穿過一個(gè)底部鋪有40 cm×8 cm白紙的隧道，將腳印記錄在白紙上。分別對(duì)正常足(N)和實(shí)驗(yàn)足(E)的腳印進(jìn)行測量和評(píng)價(jià)，包括第3趾至足跟的足印長度(print length,PL)、第1趾至第5趾的足印寬度(toe spread,TS)和第2趾至第4趾的中趾寬度(intermediary toe spread, ITS)。采用Varej?o等[12]描述的公式進(jìn)行計(jì)算：SFI=-38.3[(EPL-NPL)/NPL]+109.5[(ETS-NTS)/NTS]+13.3[(EITS-NITS)/NITS]-8。正常坐骨神經(jīng)的SFI為0，完全神經(jīng)功能障礙的坐骨神經(jīng)SFI為-100 。(2)坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度評(píng)價(jià)：將完成SFI測試的大鼠以0.3 ml/100 g 10%水合氯醛麻醉。暴露正常和手術(shù)部位的坐骨神經(jīng)，將刺激電極置于縫合線的近端，傳導(dǎo)速度記錄電極穿入腓腸肌，電刺激參數(shù)為1.0 mV，1 ms和1.0 kHz，測量坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度。(3)腓腸肌質(zhì)量評(píng)估：取每組各5只大鼠。行腹腔注射0.3 ml/100 g 10%水合氯醛麻醉。切取雙側(cè)腓腸肌，采用電子天平稱量，計(jì)算右側(cè)與左側(cè)腓腸肌質(zhì)量比值。(4)組織學(xué)評(píng)估：稱取腓腸肌質(zhì)量后，將其置于4%多聚甲醛溶液中固定12 h，置于30%蔗糖磷酸鹽緩沖液中24 h。采用冷凍切片機(jī)垂直切割為20 μm厚的組織切片4片，分別進(jìn)行HE和AchE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察。①HE染色：將玻片于蘇木精溶液中染色5 min，使細(xì)胞核變暗，洗滌10 min，于0.5%曙紅乙酸溶液(1∶100)中培養(yǎng)10 min，使肌纖維變紅，于二次蒸餾水中洗滌3 min，以去除多余的伊紅，分別于70%乙醇、90%乙醇、100%乙醇和二甲苯中排水1 min，30 s，30 s和30 s。用1～2滴二甲苯基安裝介質(zhì)安裝載玻片，并用蓋玻片覆蓋，并將載玻片儲(chǔ)存在室溫下，直至顯微鏡下觀察。②AchE染色：將載玻片置于培養(yǎng)液(碘硫代葡萄糖苷乙酰膽堿5 mg，0.1 mol/l醋酸鹽緩沖液6.5 ml，0.1 mol/l檸檬酸三鈉0.5 ml，0.03 mol/l硫酸銅1 ml，蒸餾水1 ml，0.005 mol/l鐵氰化鉀1 ml)中，37℃下培養(yǎng)4 h，脫水，以甘油明膠密封。

結(jié) 果

術(shù)后8周，所有大鼠均存活并接受了效果評(píng)價(jià)。

一、SFI評(píng)價(jià)

兩組大鼠SFI分別為微RNA-21組-47.7±2.1和GFP組-59.4±3.7，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

二、坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度

3組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度分別為正常組(30.2±1.6)m/s，微RNA-21組(16.5±1.3) m/s，GFP組(10.5±1.4) m/s，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)(圖1)。

圖1 3組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度其及比較 A GFP組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)波形圖 B 微RNA-21組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)波形圖 C 正常組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)波形圖 D 3組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的比較 圖2 微RNA-21組與GFP組大鼠腓腸肌組織光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn) A 微RNA-21組見肌纖維呈多邊形，周圍有細(xì)胞核、較完整的肌膜和肌漿(HE，標(biāo)尺=100 μm) B GFP組見肌纖維染色較微RNA組淺，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核少，肌纖維萎縮，分布不均(HE，標(biāo)尺=100 μm) C 微RNA-21組見成排的深棕色細(xì)粒亞鐵氰化銅沉積物，橢圓形，直徑較大(AchE，標(biāo)尺=100 μm) D GFP組見亞鐵氰化銅沉積物顏色稍淺，細(xì)胞較微RNA-21組小(AchE，標(biāo)尺=100 μm)

三、腓腸肌質(zhì)量評(píng)價(jià)

兩組大鼠傷側(cè)與健側(cè)腓腸肌質(zhì)量比分別為微RNA-21組0.82±0.02，GFP組0.55±0.06，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

四、組織學(xué)評(píng)價(jià)

微RNA-21組大鼠腓腸肌HE染色組織切片可見肌纖維呈多邊形，周圍有細(xì)胞核、完整的肌膜和肌漿；GFP組大鼠腓腸肌HE染色組織切片可見肌纖維染色較實(shí)驗(yàn)組淺，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核少，肌纖維萎縮，分布不均(圖2A,B)。微RNA-21組大鼠腓腸肌AchE染色組織切片可見成排的深棕色細(xì)粒亞鐵氰化銅沉積物，橢圓形，直徑較大，為20～40 μm；GFP組大鼠腓腸肌AchE染色組織切片可見亞鐵氰化銅沉積物顏色稍淺，并且較微RNA-21組小，顆粒數(shù)量較微RNA-21組明顯減少。兩組均可見肌纖維萎縮(圖2C,D)。

討 論

目前治療周圍神經(jīng)損傷的金標(biāo)準(zhǔn)是自體神經(jīng)移植。自體神經(jīng)移植不會(huì)引發(fā)免疫排斥反應(yīng)，通?？梢垣@得良好的神經(jīng)功能恢復(fù)。然而，自體神經(jīng)移植也存在手術(shù)時(shí)間長、供體神經(jīng)來源缺乏和導(dǎo)致供體部位神經(jīng)功能損傷等缺陷，這些局限性使其無法在大量患者中得到應(yīng)用[13-15]。神經(jīng)導(dǎo)管可有無限的供應(yīng)，可以避免供體部位神經(jīng)功能損傷的發(fā)生，但因不能為再生神經(jīng)提供神經(jīng)營養(yǎng)支持而無法支持長段神經(jīng)缺損的軸突再生。據(jù)此假設(shè)，如果將更多的神經(jīng)營養(yǎng)支持輸送到神經(jīng)導(dǎo)管中，可能加速軸突的再生[16-17]。

神經(jīng)元的遠(yuǎn)端結(jié)構(gòu)和功能區(qū)域，如軸突、突觸前神經(jīng)末梢和樹突，包含高度多樣的微RNA群體。這些微RNA在神經(jīng)細(xì)胞極性的發(fā)育和維持以及突觸的可塑性、再生和修復(fù)中起著特別重要的作用[18-19]。在最近一項(xiàng)研究中，Strickland等[20]使用微陣列方法分析坐骨神經(jīng)被切斷后的變化。其研究結(jié)果表明，在小鼠和大鼠背根神經(jīng)節(jié)中，L4和L5背根神經(jīng)節(jié)中的微RNA-21表達(dá)分別增加了7倍和3倍，且呈現(xiàn)微RNA-21過度表達(dá)的神經(jīng)元神經(jīng)軸突生長顯著增加。

本研究嘗試觀察在大鼠體內(nèi)微RNA-21是否能加速坐骨神經(jīng)軸突生長，并促進(jìn)坐骨神經(jīng)損傷后的功能恢復(fù)。將含有微RNA-21編碼序列的神經(jīng)導(dǎo)管載體組合應(yīng)用于橋接大鼠坐骨神經(jīng)缺損，并通過對(duì)坐骨神經(jīng)的功能評(píng)價(jià)、肌電生理評(píng)價(jià)以及組織病理學(xué)觀察對(duì)效果進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明，應(yīng)用了含有微RNA-21編碼序列載體的大鼠較應(yīng)用對(duì)照載體GFP的大鼠獲得了更好的坐骨神經(jīng)軸突生長和功能恢復(fù)。雖然目前的研究設(shè)計(jì)較為簡單，但這一結(jié)果證明微RNA可以促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷期間的軸突再生，揭示了上調(diào)微RNA-21表達(dá)在神經(jīng)缺損治療中的重要作用，為臨床周圍神經(jīng)損傷聯(lián)合治療的進(jìn)一步研究提供了證據(jù)。微RNA-21促進(jìn)神經(jīng)生長的機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，微RNA-21逆行轉(zhuǎn)染神經(jīng)元可顯著促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)損傷后的再生和功能恢復(fù)。含有微RNA-21編碼序列的慢病毒載體的應(yīng)用可能成為未來臨床試驗(yàn)中周圍神經(jīng)損傷治療的一種新方法。