俞虹宇 周 爽 蔣智淵

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，南寧市 530021，電子郵箱：1606188485@qq.com)

miRNA是一類長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其主要作用是通過(guò)與靶基因mRNA互補(bǔ)堿基配對(duì)，RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC)降解mRNA或阻礙其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)。真菌、植物和動(dòng)物中的miRNA堿基序列在物種進(jìn)化過(guò)程中相當(dāng)保守，且表達(dá)具備時(shí)序性和組織特異性[1]。由此可見(jiàn)，miRNA在物種進(jìn)化過(guò)程中起著不可替代的作用，決定著組織和細(xì)胞的功能特異性。研究表明，miRNA參與許多生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡，器官的形成，生物個(gè)體的發(fā)育、繁殖，并與人類疾病息息相關(guān)[1]。

微小RNA-142(microRNA-142，miR-142)以兩種成熟異構(gòu)體的形式存在，分別為miR-142-3p和miR-142-5p，它們是由完整miR-142雙鏈的正義鏈和反義鏈經(jīng)核糖核酸酶代謝產(chǎn)生。目前，針對(duì)miR-142-5p在心血管疾病中的作用研究，主要集中于心肌凋亡方面[2-4]，其在心血管疾病中的作用仍有待探索。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)人miR-142-5p(homo sapiens-miR-142-5p,hsa-miR-142-5p)的靶基因，并通過(guò)分析靶基因涉及的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路初步探討hsa-miR-142-5p在心血管疾病中的作用。

1 資料與方法

1.1 檢索hsa-miR-142-5p在各個(gè)組織器官中的表達(dá)情況 使用miRGator v3.0數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genome.ewha.ac.kr/miRGator/miRGator.html)對(duì)hsa-miR-142-5p進(jìn)行檢索，查看其在各個(gè)組織器官中的表達(dá)情況。

1.2 分析hsa-miR-142-5p的染色體定位及物種保守性 使用PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)檢索hsa-miR-142-5p的相關(guān)文獻(xiàn)，并結(jié)合miRBase 22.1(http://www.mirtarbase.org)和UCSC Genome Browser(http://genome.ucsc.edu/)的檢索結(jié)果，獲取其染色體定位、堿基序列和物種保守性等基本信息。

1.3 預(yù)測(cè)hsa-miR-142-5p的靶基因 利用TargetScan 7.2(http://www.targetscan.org/vert_72)、DIANA TOOLS(http://www.microrna.gr/microT-CDS)、miRDB(http://www.mirdb.org/)和miRWalk 3.0(http://www.umm.uni-heidel-berg．de/apps/zmf/mirwalk/)預(yù)測(cè)hsa-miR-142-5p的靶基因，并利用Venny.2.1.0建立Venn圖，取它們的交集。通過(guò)miRTarBase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw)獲取經(jīng)過(guò)較強(qiáng)實(shí)驗(yàn)證據(jù)驗(yàn)證的hsa-miR-142-5p的靶基因，將其與上述靶基因的交集進(jìn)行合并，組成新的基因集。

1.4 hsa-miR-142-5p靶基因集的生物功能和通路富集分析 使用基因本體論(Gene Ontology，GO)功能富集分析網(wǎng)站(http://geneontology.org/)和 DAVID 6.7數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)此基因集進(jìn)行功能富集分析，并利用京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genome.jp/kegg/)進(jìn)行信號(hào)通路富集分析。選取高頻率注釋及有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號(hào)通路進(jìn)行分析，其中以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hsa-miR-142-5p的表達(dá)情況 hsa-miR-142-5p在淋巴細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、扁桃體中的表達(dá)豐度較高，其中心臟存在基礎(chǔ)表達(dá)量。見(jiàn)圖1。

圖1 hsa-miR-142-5p在各組織器官中的表達(dá)情況

2.2 hsa-miR-142-5p的染色體定位及物種保守性 使用UCSC Genome Browser檢索，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-142-5p定位于染色體17q22，共21個(gè)堿基序列。使用miRBase檢索到包括人類在內(nèi)的共26個(gè)不同物種miR-142-5p的成熟序列，對(duì)其進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，在這26個(gè)物種中幾乎都包含了miR-142-5p的“CAUAAAGUAGAAAGCACU”18個(gè)堿基序列，表明該堿基序列在這26個(gè)物種中高度保守，見(jiàn)表1。

表1 26個(gè)物種 miR-142-5p 的成熟序列

2.3 hsa-miR-142-5p的靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果 TargetScan、DIANA TOOLS、miRDB和miRWalk軟件預(yù)測(cè)得到的 hsa-miR-142-5p靶基因分別為950個(gè)、1 934個(gè)、1 133個(gè)、956個(gè)，將4種預(yù)測(cè)方法所得的靶基因取交集后共獲得39個(gè)靶基因，分別為AFF4、AHR、AKAP11、ARMC8、ATP13A3、ATP1B1、BMPR1A、BTBD7、C21orf91、CHD9、CIT、CNTN1、EIF4E3、FAM91A1、FBXO21、FIGN、GAS7、GRSF1、HS2ST1、IL6ST、ITGAV、KITLG、MAN1A1、NFAT5、NR2C1、ONECUT2、OTUD4、PIK3CA、PUM2、RAP1A、RC3H1、SCN2A、SETX、SLC5A3、SPRY3、SPTBN1、TBC1D9、TRIM36、ZBTB37，見(jiàn)圖2。通過(guò)miRTarBase獲得12個(gè)經(jīng)較強(qiáng)實(shí)驗(yàn)證據(jù)驗(yàn)證過(guò)的靶基因，分別是CLDN1、HIF1A、IGF2BP3、NFE2L2、PTEN、RAC1、SIRT1、SMAD3、SOCS1、TGFBR2、TP53INP1、ZEB1，合并后共獲得51個(gè)候選基因，組成1個(gè)靶基因集。

圖2 4種軟件對(duì)has-miR-142-5p靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果的Venn圖

2.4 hsa-miR-142-5p靶基因集的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果 將hsa-miR-142-5p靶基因集進(jìn)行GO功能富集分析，分別獲得66項(xiàng)生物學(xué)過(guò)程、18項(xiàng)分子功能和13個(gè)細(xì)胞組分，其中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物學(xué)過(guò)程有37項(xiàng)、分子功能9項(xiàng)、細(xì)胞組分7項(xiàng)。結(jié)果顯示，靶基因功能富集在心內(nèi)膜墊融合、胚胎心管形態(tài)發(fā)生、心臟心室形態(tài)的發(fā)生和心肌肥厚的調(diào)控、心臟上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的正調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程，富集在轉(zhuǎn)錄因子β受體、蛋白激酶和特異性核酸序列等分子功能上，以及胞質(zhì)溶膠、核染色質(zhì)(體)和PML主體等細(xì)胞組分中(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 hsa-miR-142-5p靶基因的 GO分析結(jié)果

通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì) hsa-miR-142-5p靶基因集進(jìn)行基于KEGG的信號(hào)通路富集分析，共獲取24條信號(hào)通路(P<0.05)，本部分僅選取其中8個(gè)信號(hào)通路進(jìn)行分析，包括hsa-miR-142-5p靶基因富集于局灶性粘連、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinases,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號(hào)通路、叉頭框蛋白O(forkhead box O,FoxO)信號(hào)通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、甲狀腺激素信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、黏附連接、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β,TGF-β)等信號(hào)通路中(均P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 hsa-miR-142-5p靶基因的KEGG通路分析結(jié)果

3 討 論

hsa-miR-142-5p序列在人類參考基因組中被發(fā)現(xiàn)，是miR-142的家族成員之一，經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)其序列共有21個(gè)核苷酸，且在26個(gè)物種間高度保守。通過(guò)5個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，共獲得包含51個(gè)候選基因的靶基因集；GO功能富集分析結(jié)果顯示，hsa-miR-142-5p的靶基因功能富集在心內(nèi)膜墊融合、胚胎心管形態(tài)發(fā)生、心臟心室形態(tài)的發(fā)生和心肌肥厚的調(diào)控、心臟上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的正調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程，并主要集中于胞質(zhì)溶膠、染色質(zhì)(體)等細(xì)胞組分，調(diào)控轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子β受體、蛋白激酶和特異性核酸序列等分子功能。由此可見(jiàn)，hsa-miR-142-5p與多個(gè)基因相互作用，調(diào)節(jié)生命形式所必需的基本功能。

研究表明，擴(kuò)張型心肌病患兒的外周血miR-142-5p表達(dá)顯著上調(diào)，miR-142-5p有可能成為診斷擴(kuò)張型心肌病和評(píng)估心力衰竭的潛在生物指標(biāo)[5]。還有研究表明， miR-142-5p表達(dá)下調(diào)與非ST段抬高型的急性冠脈綜合征患者慢性心力衰竭的發(fā)生有關(guān)[6]。此外，母體血清中miR-142-5p表達(dá)下調(diào)與胎兒先天性心臟缺陷的發(fā)生相關(guān)[7]。Pan等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-142-5p的循環(huán)水平在支架內(nèi)在狹窄患者中顯著升高。上述研究提示miR-142-5p或可作為診斷心血管疾病的血清學(xué)標(biāo)志物，但其在上述疾病發(fā)生中的具體作用仍有待探索。近期，已有學(xué)者對(duì)miR-142-5p在心血管疾病發(fā)生中的作用進(jìn)行了探索。Du等[2]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA GAS5可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA與miR-142-5p結(jié)合，沉默長(zhǎng)鏈非編碼RNA GAS5表達(dá)可促進(jìn)miR-142-5p表達(dá)，從而激活PI3K/Akt和絲裂原活化蛋白激酶激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)通路，減少缺氧造成的大鼠心肌凋亡。Wang等[9]的研究表明， miR-142-5p與miR-212-5p協(xié)同抑制c-Myc/腫瘤蛋白p53誘導(dǎo)核蛋白1信號(hào)通路，從而抑制小鼠心肌梗死后心臟成纖維細(xì)胞增生和膠原纖維分泌，改善心臟功能。Shrestha等[4]發(fā)現(xiàn)，miR-142-5p可以控制出生后心肌細(xì)胞的適應(yīng)性生長(zhǎng)，是調(diào)控心肌細(xì)胞適應(yīng)性肥厚的關(guān)鍵因子；miR-142-5p表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致小鼠心肌細(xì)胞過(guò)度凋亡、心臟明顯擴(kuò)張和心功能障礙。此外，還有研究表明，miR-142-5p還能通過(guò)下調(diào)B細(xì)胞易位基因3促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖[10]。

上述研究多集中在miR-142-5p心肌細(xì)胞凋亡中的作用，個(gè)別研究涉及心肌纖維化及平滑肌細(xì)胞增殖。我們利用生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-142-5p與心內(nèi)膜墊融合、胚胎心管形態(tài)發(fā)生、心臟心室形態(tài)發(fā)生和心肌肥厚的調(diào)節(jié)有關(guān)，提示hsa-miR-142-5p可能在先天性心臟病和心肌肥厚的發(fā)生中起著重要作用，此外，hsa-miR-142-5p還參與了心臟上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控，這可能與心肌纖維化有關(guān)[11]。我們還發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-142-5p參與PI3K/Akt信號(hào)通路、黏附連接、TGF-β信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路和FoxO信號(hào)通路的調(diào)控。研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路與心肌纖維化和心肌肥厚有關(guān)[12-13]，黏附連接信號(hào)通路對(duì)于維持血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障及正常功能起著重要作用[14]，TGF-β信號(hào)通路與心肌纖維化密切相關(guān)[15]，甲狀腺激素信號(hào)通路與心肌肥厚有關(guān)[16]，Rap1信號(hào)通路則主要與血管平滑肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控有關(guān)[17-18]，而FoxO信號(hào)通路則主要與心肌肥厚的調(diào)控有關(guān)[19]。上述結(jié)果提示，hsa-miR-142-5p在先天性心臟病、心肌肥厚、心肌纖維化、血管平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)控中具有一定的作用，可作為今后進(jìn)一步研究的方向，而PI3K/Akt信號(hào)通路、黏附連接、TGF-β信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路和FoxO信號(hào)通路則為進(jìn)一步探索hsa-miR-142-5p在上述病理生理過(guò)程中的具體機(jī)制提供了線索。

綜上所述，hsa-miR-142-5p的靶基因可能與先天性心臟病、心肌肥厚、心肌纖維化、血管平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)控有關(guān)，而PI3K/Akt信號(hào)通路、黏附連接、TGF-β信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路和FoxO信號(hào)通路可能參與上述病理生理過(guò)程。上述結(jié)果為進(jìn)一步研究hsa-miR-142-5p在心血管疾病發(fā)生中的作用及機(jī)制提供了一定的線索。