◎ 鄭 蓉，張 娟，姜美勤

（鈦和檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)股份有限公司，上海 200060）

食品安全與人們的身體健康密切相關(guān)。但是，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，為了防治各種疾病、縮短養(yǎng)殖周期、追求產(chǎn)量，存在不合理用藥、違禁使用藥物的問(wèn)題，造成水產(chǎn)品中抗生素殘留超標(biāo)，還出現(xiàn)了為防治水霉病而使用孔雀石綠的事件以及“3·15”曝光的海參除草劑事件等，因此中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部對(duì)我國(guó)的食品安全問(wèn)題也日益重視。

人工合成的類(lèi)固醇藥物甲基睪酮（Methyltestosterone，MT），呈白色或乳白色結(jié)晶性粉末，具有雄性和蛋白同化雙重作用。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，苗種培育和性別控制的特效藥物之一——甲基睪酮，受到養(yǎng)殖戶的青睞[1]。但攝入含有甲基睪酮?dú)埩舻乃a(chǎn)品會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生危害，可能會(huì)造成人體激素水平失衡，肝中毒、胎體中毒等。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中已明確規(guī)定，禁止使用甲基睪酮等激素類(lèi)藥物作為動(dòng)物培育的“性誘導(dǎo)劑”，在水產(chǎn)品中不得檢出甲基睪酮，因此對(duì)水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩魴z測(cè)方法的研究在食品安全行業(yè)中必不可少。本文概述了甲基睪酮的作用機(jī)制、危害和相關(guān)法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)，針對(duì)水產(chǎn)品中甲基睪酮的前處理方法和檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)綜述，并分析了未來(lái)需要解決的技術(shù)挑戰(zhàn)，對(duì)今后的研究進(jìn)行了展望，旨在為水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩魴z測(cè)和監(jiān)管提供技術(shù)提供參考。

1 甲基睪酮概述

1.1 甲基睪酮的機(jī)理

甲基睪酮又叫甲基睪丸素和甲睪酮，是一種蛋白同化雄性激素。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，甲基睪酮曾一度被用于苗種培育和性別控制，主要是為了增強(qiáng)受體的雄性體性、提高養(yǎng)殖產(chǎn)量等[2]。這是因?yàn)榧谆G酮可以促進(jìn)線粒體的生物合成和質(zhì)量控制，通過(guò)促進(jìn)紅細(xì)胞生成和加強(qiáng)毛細(xì)血管來(lái)增加組織的凈氧輸送，使得動(dòng)物體內(nèi)蛋白合成和肌肉增長(zhǎng)的速率加快，其主要通過(guò)影響魚(yú)體的性類(lèi)固醇激素含量，如雌二醇、睪酮等水平進(jìn)而誘導(dǎo)雌魚(yú)雄性化，也可通過(guò)影響硬骨魚(yú)類(lèi)性別分化相關(guān)基因的表達(dá)，來(lái)達(dá)到控制性別的目的[3]。甲基睪酮的生長(zhǎng)促進(jìn)作用與生長(zhǎng)激素的代謝升高有關(guān)。

由于甲基睪酮的特殊作用，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中會(huì)存在違法使用甲基睪酮的行為。據(jù)報(bào)道，不同含量的甲基睪酮對(duì)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)、代謝和發(fā)育等生理過(guò)程具有不同程度的影響。目前已有報(bào)到，甲基睪酮成功誘導(dǎo)了羅非魚(yú)（Oreochromis mossambicus）和虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、點(diǎn)帶石斑魚(yú)（Epinephelus coioides）等多種魚(yú)類(lèi)發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，研究發(fā)現(xiàn)用含有 50 mg·kg-1和 100 mg·kg-117α- 甲 基 睪 酮 的 飼 料投喂出膜后15 d的大口黑鱸60 d，均獲得100%的雄 性率[4]。 研究表明，用 0 mg·kg-1、100 mg·kg-1和250 mg·kg-1濃度的甲基睪酮處理中國(guó)對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis），發(fā)現(xiàn)不同組之間沒(méi)有顯著差異，然而在500 mg·kg-1和1 000 mg·kg-1的高劑量下，東方河對(duì)蝦生長(zhǎng)性能顯著增強(qiáng)，但是性腺發(fā)育延遲，這與之前的研究一致，即快速性腺發(fā)育會(huì)對(duì)水生物種的生長(zhǎng)性能產(chǎn)生負(fù)面影響[5]。穆迎春等[6]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的甲基睪酮對(duì)魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，而高濃度則會(huì)產(chǎn)生抑制作用，濃度為1～5 mg·L-1可促進(jìn)金魚(yú)和鯉魚(yú)生長(zhǎng)；濃度為10～50 mg·L-1會(huì)導(dǎo)致金魚(yú)或羅非魚(yú)由雌性向雄性完全逆轉(zhuǎn)；濃度為100 mg·L-1以上可使異育銀鯽變?yōu)橹行圆挥~(yú)。因此，甲基睪酮的使用量非常關(guān)鍵，會(huì)對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)生不同的影響。

1.2 甲基睪酮?dú)埩舻奈：?/h3>

甲基睪酮被作為一種性激素和強(qiáng)壯劑添加到飼料中時(shí)，雖然具有增加水產(chǎn)品產(chǎn)量和控制性別等優(yōu)勢(shì)，但是這類(lèi)激素在動(dòng)物體內(nèi)代謝緩慢、不易分解，當(dāng)人體食用含有甲基睪酮?dú)埩舻乃a(chǎn)品時(shí)會(huì)對(duì)自身身體健康造成巨大危害，導(dǎo)致肝中毒或其他重要組織器官發(fā)生生理病變，甚至具有潛在的致畸、致癌、致突變性。有研究表明，甲基睪酮代謝時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)人類(lèi)的危害是慢性、長(zhǎng)期和累積性的。甲基睪酮的危害主要表現(xiàn)在痕量殘留會(huì)干擾人體內(nèi)自然激素的平衡，導(dǎo)致正常人生理功能紊亂，還可能造成女性消費(fèi)者出現(xiàn)痤瘡、多毛、聲音變粗、閉經(jīng)、乳腺退化和性欲改變等男性化現(xiàn)象，甚至對(duì)新生兒有致畸作用，干擾肝內(nèi)毛細(xì)膽管的排泄功能，引起膽汁郁積性黃疸，影響兒童的正常生長(zhǎng)發(fā)育[7]。

目前，不少國(guó)家已經(jīng)禁止在水產(chǎn)品養(yǎng)殖中使用此種激素，并要求水產(chǎn)品中不得檢出該激素。歐盟和美國(guó)都規(guī)定在養(yǎng)殖中不允許使用甲基睪酮等性激素類(lèi)藥物，中國(guó)在《無(wú)公害食品 水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》（NY 5070—2002）中將甲基睪酮明確列為禁用藥物，中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中也規(guī)定甲基睪酮為禁用獸藥。

2 檢測(cè)樣品前處理方法

針對(duì)甲基睪酮的殘留檢測(cè)，其樣品前處理的主要步驟包括用有機(jī)試劑進(jìn)行提取、溶液濃縮和凈化等。因水產(chǎn)品組分復(fù)雜，含有大量蛋白和脂肪，且有些成分與甲基睪酮在結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)上都相似，前處理步驟在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中至關(guān)重要。提取是通過(guò)化學(xué)或物理方法從物質(zhì)中制取有用成分，一般是在確保待測(cè)組分的最大提取率和減少樣品基質(zhì)中雜質(zhì)的基礎(chǔ)上選擇提取方法和溶劑。優(yōu)異的凈化條件能夠降低基質(zhì)效應(yīng)、提高方法靈敏度、保證凈化效果和回收率，因此不同基質(zhì)樣品需要采用不同的凈化方法。甲基睪酮檢測(cè)常用的前處理方法有液-液萃取技術(shù)（Liquid–Liquid Extraction，LLE）、 固 相 萃 取 技 術(shù)（Soild Phase Extraction，SPE）等[8]。樣品中甲基睪酮檢測(cè)的樣品前處理方法見(jiàn)表1。

2.1 液-液萃取技術(shù)

LLE是利用混合物中各組分在兩種不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離目的，通常采用漏斗振蕩或渦旋萃取兩種方式。激素類(lèi)藥物殘留分析中常用的提取溶劑有甲醇、乙腈、丙酮、乙醚和乙酸乙酯等?；谌軇┳陨硖匦院蜆悠坊|(zhì)來(lái)說(shuō)，甲醇、乙腈和丙酮易與樣品結(jié)合，提取速度快；乙醚和乙酸乙酯適于提取脂溶性化合物[8]。乙腈是甲基睪酮?dú)埩魴z測(cè)常用的有機(jī)溶劑，可將被測(cè)組分從大量?jī)?nèi)源性物質(zhì)中分離出來(lái)，具有沉淀蛋白的作用，可減少雜質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾。中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩袅康臏y(cè)定 液相色譜法》（SC/T 3029－2006）中采用的提取方式就是用大量的石油醚和乙腈進(jìn)行液液萃取，由于液液萃取操作步驟煩瑣、成本高、需要消耗大量的有機(jī)溶劑，后期的很多研究都在選取優(yōu)化的萃取方式[14]。

2.2 固相萃取技術(shù)

在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中，SPE是經(jīng)常會(huì)使用到的一種凈化方法，可采用不用類(lèi)型的固相萃取柱凈化樣品，該方法利用目標(biāo)物與吸附劑之間的作用力來(lái)保留或吸附的原理，確保達(dá)到分離效果。黃鸞玉等[10]比較 了 ODS-C18柱（200 mg/3 mL） 和 poly-sery HLB（60 mg/3 mL）對(duì)水產(chǎn)樣品提取液的凈化效果，結(jié)果表明C18柱回收率低于50%，HLB柱回收率可達(dá)90%，因此選擇HLB柱凈化樣品。李佩佩等[11]建立了水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩舻母咝б合嗌V的測(cè)定方法，在樣品前處理階段選擇LC-C18柱進(jìn)行凈化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該方法在7.0～200 μg·kg-1添加范圍內(nèi)的平均回收率為82.0%～86.0%。萬(wàn)譯文等[12]選擇了4種不同的固相萃取柱（C18500 mg/3 mL、HLB60 mg/3 mL、Alumina-N 60 mg/3 mL和 PCX 60 mg/3 mL）比較對(duì)甲基睪酮的凈化效果，最后選擇了Alumina-N中性氧化鋁柱（60 mg/3 mL），此固相萃取-高效液相色譜法步驟簡(jiǎn)單，凈化效果好。

3 甲基睪酮的檢測(cè)方法

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩魴z測(cè)方法進(jìn)行了相應(yīng)的研究和報(bào)導(dǎo)，研究較多的主要有高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[13]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）法[14-16]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Liquid Chromatography Tandem mass Spectrometry，LC-MS/MS）[17-19]、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）[20]、毛細(xì)管電泳法（Capillary Electrophoresis，CE）[21]和化學(xué)發(fā)光法[22]。水產(chǎn)品中甲基睪酮檢測(cè)方法比較見(jiàn)表2。

表2 水產(chǎn)品中甲基睪酮檢測(cè)方法比較表

3.1 高效液相色譜法

色譜法是在甲基睪酮檢測(cè)中應(yīng)用較為普遍的一種方法，其檢測(cè)的準(zhǔn)確度和靈敏度較高，主要包括液相色譜和氣相色譜，SC/T 3029－2006就明確了使用液相色譜的方法。近些年來(lái)通過(guò)對(duì)此檢測(cè)方法應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，此方法樣品處理步驟繁多，檢測(cè)限較高，為10 μg·kg-1；回收率低于70%，不適合用于批量檢測(cè)，需要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的改良。陳培基等[23]在《水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩袅康臏y(cè)定 液相色譜法》（SC/T 3029－2006）標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，改進(jìn)了樣品前處理和色譜條件，建立了測(cè)定甲基睪酮的高效液相色譜條件。彭家杰等[24]研究?jī)?yōu)化了高效液相色譜法中的樣品轉(zhuǎn)移操作、濃縮和凈化流程、色譜條件等，使回收率和工作效率都得到了提高。黃鸞玉等[10]通過(guò)優(yōu)化提取凈化方法，建立了超高效液相色譜分析方法，檢出限為5.0 μg·kg-1，提高了工作效率，減少了試劑消耗量。

3.2 色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法是有機(jī)物定性、定量分析的有利工具。REGAL等[25]采用液質(zhì)聯(lián)用的方法（LC-MS）測(cè)定甲基睪酮的含量，發(fā)現(xiàn)該方法的檢測(cè)限小于5.0 μg·kg-1，有效提高了測(cè)定的靈敏度與準(zhǔn)確度。羅柏華[26]建立了液相色譜－電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定的方法，該方法的定量限范圍為0.1 μg·L-1；楊霄等[27]建立了分散固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩袅康姆椒?，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲基睪酮在1～200 ng·mL-1線性關(guān)系良好，方法的檢出限為0.5 μg·kg-1，定量限為 1.0 μg·kg-1，用該法對(duì)羅非魚(yú)、中華鱉、凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，回收率為82.4%～96.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于6.98%。

3.3 免疫分析學(xué)方法

免疫分析法是利用毒物與標(biāo)記毒物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗體檢測(cè)毒物的方法，適合于復(fù)雜基質(zhì)中痕量組分的分析。DAZKIEWICZ等[28]報(bào)道了測(cè)定魚(yú)飼料和豬飼料中甲基睪酮的殘留方法為直接競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫方法和膠體金免疫層析法，其檢測(cè)結(jié)果與氣相色譜-質(zhì)譜分析方法結(jié)果一致，說(shuō)明該法可廣泛應(yīng)用于甲基睪酮的殘留檢測(cè)。LUA等[29]建立了牛尿中甲基睪酮的酶聯(lián)免疫檢測(cè)法，檢測(cè)限為266 pg·mL-1。王強(qiáng)等[30]建立了間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩簦l(fā)現(xiàn)該方法的抑制中濃度IC50為3.48 μg·L-1。夏武強(qiáng)等[31]通過(guò)膠體金標(biāo)免疫層析技術(shù)（Goldimmunochromatographicas Say，GICA） 建 立了甲基睪酮快速測(cè)試方法，將待測(cè)樣品中的甲基睪酮和試紙條檢測(cè)線上包被的人工抗原甲基睪酮偶聯(lián)抗原（MT-BSA）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合金標(biāo)結(jié)合墊上包被的膠體金-甲基睪酮單抗聚合物，根據(jù)檢測(cè)線呈現(xiàn)的紅色線條深淺來(lái)判定樣品的陰陽(yáng)性，發(fā)現(xiàn)測(cè)試時(shí)間僅需10～15 min，試紙條的最低檢測(cè)限達(dá)到10 μg·kg-1。

3.4 其他檢測(cè)技術(shù)

除了高效液相色譜法、色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法、免疫分析學(xué)方法之外，還有毛細(xì)管電泳-紫外檢測(cè)法（檢出限1 μg·mL-1）、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法等其他檢測(cè)方法。

4 結(jié)語(yǔ)

甲基睪酮是一種人工合成的雄性激素，添加在水產(chǎn)品的飼料中可以提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，提高動(dòng)物生長(zhǎng)速率。但是甲基睪酮代謝緩慢，蓄積性強(qiáng)，通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，因此對(duì)甲基睪酮?dú)埩魴z測(cè)就顯得尤為重要。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于高效準(zhǔn)確檢測(cè)甲基睪酮在水產(chǎn)品中殘留的研究尚不完善，有待于進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)和探索。對(duì)于甲基睪酮的前處理方法，相較于的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T 3029—2006中液-液萃取技術(shù)，現(xiàn)在更常用的是能減少溶劑消耗，有效降低樣品基質(zhì)效應(yīng)的固相萃取技術(shù)。目前對(duì)于檢測(cè)方法的研究主要有高效液相色譜法，該方法使用儀器價(jià)格適中，檢測(cè)的準(zhǔn)確度和靈敏度較高，可滿足日常檢測(cè)的需要，但是前處理步驟復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、不適合批量檢測(cè)；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法前處理方法簡(jiǎn)單、能快速檢測(cè)水中激素殘留，但是儀器價(jià)格昂貴；氣相色譜-質(zhì)譜法具有靈敏度高、試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠等優(yōu)點(diǎn)，但需要對(duì)分析物進(jìn)行衍生化，結(jié)果不穩(wěn)定；酶聯(lián)免疫吸附法是公認(rèn)的操作簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和樣品通量高等優(yōu)點(diǎn)，但缺點(diǎn)是無(wú)法精準(zhǔn)定性定量，只能用作初步篩查。時(shí)代發(fā)展對(duì)藥物殘留相應(yīng)的配套檢測(cè)技術(shù)提出了快速、準(zhǔn)確的要求。因此探索前處理方法簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高的檢測(cè)技術(shù)用于水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩魴z測(cè)，將具有較為廣闊的應(yīng)用前景。