◎ 徐 梅，王常青，趙大洲

（1.廈門元之道生物科技有限公司，福建 廈門 361100；2.山西大學，山西 太原 030006）

火麻（Cannabis sativaL.）又名漢麻、線麻等，為桑科大麻屬一年生草本植物，廣泛分布在亞歐的溫帶和熱帶地區(qū)，成熟的火麻仁種子可提取食用油脂和蛋白質(zhì)?；鹇槿势墒翘崛∈秤没鹇槿视秃蟮娘炂?，蛋白質(zhì)含量50%～70%，國內(nèi)外已見到用蛋白酶水解火麻仁蛋白制取多肽的報道[1-2]?，F(xiàn)有制備的火麻仁多肽的工藝多采用堿溶酸沉法提取火麻仁蛋白，然后再用堿性或中性蛋白酶水解多肽，獲得的活性多肽為抗氧化肽和降壓肽，目前尚未見到用多種蛋白酶依次水解火麻仁粕制備具有抑制胰α-淀粉酶和胰脂肪酶活性多肽的報道，也未見到火麻仁多肽減肥功能的實驗研究[3-4]。本文用酸性蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶3次水解脫脂火麻仁粕，得到的多肽經(jīng)膜分離后得到了分子量300～6 000 Da的活性多肽，并研究了該多肽對肥胖模型小鼠的減肥效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火麻仁粕，山西宏田嘉利農(nóng)業(yè)科技有限公司；3.350酸性蛋白酶（3.350酶）、537酸性蛋白酶（537酶）、胃蛋白酶、MSD酸性蛋白酶（MSD酶）、3.4310酸性蛋白酶（3.4310酶）和中性蛋白酶，肽度科技（廈門）有限公司；阿卡波糖，德國拜爾公司；奧利司他膠囊，重慶華森制藥股份有限公司；α-淀粉酶和胰脂肪酶，Sigma公司；昆明種小鼠SPF級，山西醫(yī)科大學實驗動物中心；動物飼料及輔料，山西醫(yī)科大學實驗動物中心；其他化學試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2600型紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）有限公司；高速離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司；超濾-納濾膜組件，中科瑞陽膜技術(shù)（北京）有限公司；全自動定氮儀，上海寶英光電科技有限公司；UVD-680-3紫外檢測儀及色譜工作站，上海金達生物科技有限公司；Thermo MR23冷凍離心機，美國熱電公司；Spectramax M5多功能酶標儀，天津泰科嘉華金屬貿(mào)易有限公司；其他均為常規(guī)儀器。

1.3 試驗方法

1.3.1 火麻仁多肽的制備與分離

（1）酸性蛋白酶水解制備火麻仁多肽的工藝研究?；鹇槿势煞郯戳弦海ㄙ|(zhì)量）比1∶20加水浸泡，調(diào)pH值至2.5～3.0，倒入膠體磨磨漿，將勻漿料液等分為8份，分別為L、M、N、O、P、Q、R和S，其中L和M樣品加入3.4310酶，N和Q樣品加入537酶，O和R樣品加入MSD酶，P和S樣品加入3.350酶，加酶量5 000 u·g-1，按樣品中蛋白計。各樣品在50～52 ℃水解70 min后，加熱滅酶；然后在M、N、O和P樣品中分別加入胃蛋白酶2 600 u·g-1，40～42 ℃水解45 min后加熱滅酶，離心取上清液；L、Q、R和S樣品不經(jīng)胃酶水解，離心取上清液。8份上清液經(jīng)膜分離濃縮后，稀釋至15 mg·mL-1檢測α-淀粉酶、脂肪酶抑制率，選出消化酶抑制活性高的上清液A保存。

（2）中性蛋白酶二次水解火麻仁粕殘渣的時間與溫度實驗。取上清液A離心得到的沉淀殘渣，加入一定量的水和5 000 u·g-1的中性蛋白酶，在pH值為7.5和50 ℃下，分別取樣水解60～160 min，將殘渣的水解液滅酶后，離心得到上清液B，檢測計算B液的多肽得率和15 mg·mL-1含量下的脂肪酶抑制率，以確定適宜水解時間。取上清液A離心的殘渣，分別在40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和 60 ℃水解 120 min，以確定適宜水解溫度。其他工藝條件同上。

（3）火麻仁活性多肽的膜分離篩選方法。將A、B兩上清液混合后，分別用截留分子量為10 000 Da、6 000 Da、4 000 Da和2 000 Da的超濾膜和300 Da的納濾膜分離，得到5個分子量Mw組分（6 000～10 000 Da、4 000～6 000 Da、2 000～4 000 Da、＜2 000 Da和300～6 000 Da）；將5段多肽分離液調(diào)整到多肽含量15 mg·mL-1后，測定各肽段的消化酶抑制率和質(zhì)量百分比（色譜工作站軟件），確定最佳活性分子段。

1.3.2 多肽含量的測定方法

多肽含量按《大豆肽粉》（GB/T 22492—2008）中附錄B的方法測定。

1.3.3 多肽得率Q的計算方法

多肽得率Q的就算公式如下：

式（1）中：S為水解液（離心或超濾）中多肽的含量，g·mL-1；T為水解液的體積，mL；W為水解原料液中的粗蛋白量，g。

1.3.4 α-淀粉酶和脂肪酶活抑制率的測定與計算

α-淀粉酶抑制率采用3,5二硝基水楊酸比色法測定[5]；脂肪酶抑制率的檢測與計算參照文獻中方法[6]，其中脂肪酶活力的測定按照《脂肪酶制劑》（GB/T 23535—2009）的方法。

1.3.5 火麻仁多肽的減肥實驗方法

選成年雄性小鼠，屏障系統(tǒng)下基礎(chǔ)飼料適應喂養(yǎng)7 d，按體重分成5組，分別為基礎(chǔ)組、基礎(chǔ)+多肽組、高熱量模型組、多肽小劑量組和多肽大劑量組。基礎(chǔ)組和基礎(chǔ)+多肽組動物喂食基礎(chǔ)飼料，其余3組動物喂高熱量飼料（見表1），每日定量供食，自由飲水，飼養(yǎng)溫度為（22±2）℃，濕度40%～60%?；A(chǔ)組和高熱量模型組每天灌胃乳清蛋白［1 g·（kg·d）-1］；基礎(chǔ)+多肽組每天灌胃火麻仁多肽和乳清蛋白各0.5 g·kg-1；多肽小劑量組［0.8 g·（kg·d）-1］和多肽大劑量組［1.6 g·（kg·d）-1］每天灌胃火麻仁多肽。實驗期4周，實驗前后稱體重，結(jié)束后處死動物，摘取睪丸及腎周圍脂肪墊稱重，計算脂體比和體重增重率。統(tǒng)計攝食量和攝入總熱量（攝入總熱量=攝食量×每公斤飼料熱量），進行分析總結(jié)。飼料配方見表1。

表1 飼料配方表

2 結(jié)果與分析

2.1 火麻仁多肽最佳工藝條件的確定

2.1.1 酸性蛋白酶+胃蛋白酶最佳組合水解工藝的確定

不同蛋白酶組合水解火麻仁多肽的活性數(shù)據(jù)如表2所示，所有火麻仁酶解樣品均無脂肪酶抑制活性；缺少用胃蛋白酶二次水解的水解液L、R和S沒有α淀粉酶抑制活性，537酶一次水解的火麻仁水解液Q的α淀粉酶抑制率為42.5%，但是經(jīng)過胃蛋白酶二次水解后的水解液N的α淀粉酶抑制率只有22.35%，說明537酶水解多肽的α淀粉酶抑制活性對胃蛋白酶的耐受性差；只有用3.4310酶+胃蛋白酶依次水解的水解液M可產(chǎn)生較高的α淀粉酶抑制率，同時也預示這種活性多肽有一定的過胃穩(wěn)定性，因此，這兩種酶組合的水解工藝作為第一階段酶解活性肽的優(yōu)選。將M水解液的離心上清液A冷藏，以備后期合并超濾和檢測。將M水解料液的離心沉淀殘渣作為第二階段中性蛋白酶解試驗的底物。

表2 不同蛋白酶組合水解火麻仁多肽的活性數(shù)據(jù)表（多肽濃度 15 mg·mL-1）

2.1.2 沉淀殘渣適宜酶解時間的試驗結(jié)果

采用3.4310酶和胃蛋白酶依次水解得到的火麻仁多肽的α淀粉酶抑制率可達到66.59%，但是火麻仁蛋白的多肽得率只有34%～38%。因此本文將水解M料液的離心沉淀用中性蛋白酶再次水解，結(jié)果如圖1所示，在水解80～140 min時脂肪酶抑制率變化不大，超過140 min后，脂肪酶抑制率逐漸下降；多肽得率在水解120 min時最高，之后逐漸下降，綜合以上兩方面因素，確定M料液沉渣水解120 min為中性蛋白酶酶解的適宜時間。

圖1 水解時間對多肽得率和脂肪酶抑制率的影響圖

2.1.3 沉淀殘渣適宜酶解溫度的實驗結(jié)果

從圖2可以看出，沉淀殘渣在40～55 ℃溫度范圍內(nèi)水解，脂肪酶抑制率變化不大；50 ℃時多肽得率最高，低于50 ℃時得率較低，該蛋白酶未發(fā)揮出有效活性，高于50 ℃時多肽得率隨溫度下降較快，可能與水解溫度高，酶容易失活有關(guān)。因此適宜水解溫度為50 ℃。

圖2 水解溫度對脂肪酶抑制率與多肽得率的影響圖

結(jié)合前期加酶量和pH值單因素實驗（省略未列出），最終確定中性蛋白酶水解M料液沉渣的適宜條件為加酶量5 000 u·g-1、pH值為7.5、溫度50 ℃和時間120 min，得到的水解液經(jīng)離心獲得上清液B，供下一步膜分離。

2.2 火麻仁活性多肽的膜分離篩選結(jié)果

將上清液B與上清液A合并后，經(jīng)膜分離得到5個分子量段的火麻仁多肽，檢測結(jié)果見表3。α-淀粉酶抑制活性高的多肽在4 000～6 000 Da分子段，2 000～4 000 Da段多肽雖有一定活性，但活性較小，有可能是前段的活性大分子從4 000 Da的超濾膜漏出所致；而抑制脂肪酶活性高的分子集中在2 000 Da段以下，2 000～4 000 Da段的多肽也有一定活性，有可能是2 000 Da的超濾膜未將小分子活性多肽全部濾出。如果想分別得到兩種消化酶抑制活性高的多肽，就要通過2次超濾和2次納濾，加工成本高，工藝煩瑣。而通過一次超濾和一次納濾得到的300～6 000 Da的多肽段同時包含了較高的α-淀粉酶抑制活性和脂肪酶抑制活性，且質(zhì)量百分比達到81.65%，多肽得率為53.6%，具有工藝簡單，消化酶的綜合抑制活性高的優(yōu)點，因此選用300～6 000 Da的多肽為本研究的火麻仁活性多肽。

表3 各段多肽的α-淀粉酶和脂肪酶抑制率表（多肽濃度15 mg·mL-1）

2.3 火麻仁活性多肽的減肥動物實驗結(jié)果

動物實驗表明（表4），與高熱量組相比，同樣攝入高熱量飼料的火麻仁活性多肽大、小劑量組動物的脂肪體重比和體重增重率明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），大劑量組的脂肪體重比降低效果優(yōu)于小劑量組。說明該多肽中的α-淀粉酶抑制肽和脂肪酶抑制肽通過抑制淀粉和脂肪的吸收減緩了肥胖模型動物的體重增長，也說明該火麻仁活性多肽可以抵抗胃蛋白酶和腸肽酶的降解，在小腸中保持一定的活性，可加工成減肥功能食品。此外，對比基礎(chǔ)組和基礎(chǔ)+多肽組的可以發(fā)現(xiàn)，健康動物在喂食常規(guī)飼料并攝入適量的火麻仁多肽后，體重增重率雖然比未攝入多肽的動物有所降低，但是并無顯著差異，說明適量攝入該多肽對正常動物的體重等無明顯影響。

表4 火麻仁活性多肽對小鼠體重增重率及脂肪體重比的影響表（）

表4 火麻仁活性多肽對小鼠體重增重率及脂肪體重比的影響表（）

注：*表示與模型組相比P＜0.05；**表示P＜0.01。

組別 數(shù)量 每只攝入總熱量/kJ每只總攝食質(zhì)量/g 體重增重率/% 脂肪/體重基礎(chǔ)組 9 1 432.0 90 22.30±4.22* 2.39±0.40*基礎(chǔ)+多肽組 9 1 432.0 90 19.97±5.34* 2.20±0.33*高熱量組 8 1 719.5 90 28.56±5.71 3.66±0.46多肽大劑量組 9 1 719.5 90 14.48±3.85** 1.91±0.30**多肽小劑量組 9 1 719.5 90 16.10±4.10** 2.46±0.34*

3 結(jié)論

綜上所述，脫脂火麻仁粕選用3.4310性蛋白酶+胃蛋白酶依次水解，可以得到具有抑制α-淀粉酶活性的火麻仁多肽，α-淀粉酶抑制率可以達到66.59%，但是第一階段水解多肽得率只有34%～38%，因此本文將3.4310酶+胃蛋白酶水解液的離心沉淀物再用中性蛋白酶水解，可以獲得具有脂肪酶抑制活性的多肽水解液，多肽得率在18%左右，第二階段水解的適宜條件為溫度50 ℃、時間120 min、pH值為7.5和加酶量5 000 u·g-1。將第一、第二階段的酶解多肽的分離液合并后，經(jīng)過膜分離得到的300～6 000 Da的混合多肽的α-淀粉酶抑制率為52.18%，脂肪酶抑制率為36.79%，該活性肽的得率為53.6%。動物實驗表明，該活性肽對高熱量模型小鼠的減肥效果好，各劑量組與模型組相比均有顯著差異（P＜0.05），可開發(fā)為減肥功能食品。