李寧 陳瑾 張錄民

肺癌是最常見和最致命的惡性腫瘤之一，目前肺癌的診斷策略仍然難以在早期識別出該疾病[1]。因此，需要進一步的研究來探索新穎的診斷和治療生物標志物，并揭示肺癌進展的詳細潛在機制。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一種新型的非編碼RNA，由沒有自由末端的共價閉環(huán)結(jié)構形成[2]。由于高通量測序的進展，已發(fā)現(xiàn)多種circRNA在肺癌等癌癥中呈現(xiàn)異常表達，這些circRNA可能對肺癌的早期診斷和治療產(chǎn)生廣泛影響[3,4]。circRNA主要依靠微小RNA(micro RNA，miRNA)海綿發(fā)揮其生物學功能[5]。在肺癌中，人們已經(jīng)認識到一些circRNA，例如CircRNA CDR1as[6]和circRNA_102179[7]起著競爭性內(nèi)源性RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)的作用，以減輕對miRNA靶標的抑制作用。circ_0008035是一種新鑒定的在胃癌中上調(diào)的circRNA，通過靶向miR-375/YBX1軸促進胃癌的發(fā)生[8]，但circ_0008035在肺癌中的功能和機制仍然未知。本研究通過生物學預測發(fā)現(xiàn)，circ_0008035與miR-188-3p存在互補位點，miR-188-3p與高遷移率族蛋白B2(high-mobility group protein B2，HMGB2)具有靶向結(jié)合位點。miR-188-3p過表達可以抑制非小細胞肺癌進展[9]，敲減HMGB2可抑制肺腺癌細胞的增殖[10]。然而，miR-188-3p和HMGB2是否涉及肺癌中circ_0008035的功能尚不確定。因此，本研究探討circ_0008035在肺癌中的表達和對肺癌細胞增殖、凋亡的影響，結(jié)合miR-188-3p/HMGB2探討circ_0008035的分子機制。

1 材料與方法

1 標本 2017年月3至2019年11月首都醫(yī)科大學附屬復興醫(yī)院和吉林省人民醫(yī)院招募25例未接受化學療法或放射療法的肺癌患者，患者均知情且同意參加研究，本研究得到醫(yī)院倫理委員會的批準。手術過程中收集患者的肺癌組織和癌旁組織，并保存在-80℃下直至分離RNA。

1.2 細胞與試劑 肺癌A549細胞(美國ATCC)，circ_0008035干擾物(si-circ_0008035)、干擾物陰性對照si-NC、miR-188-3p mimics、miR-188-3p inhibitors(anti-miR-188-3p)、mimics陰性對照(miR-NC)(上海Gene Pharma)，PrimeScrip RT試劑盒(大連Takara)，AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京Vazyme)，RIPA緩沖液、ECL試劑(北京Solarbio)，HMGB2兔多克隆抗體(美國Abcam)，膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙錠(Propidium Iodide，PI)細胞凋亡檢測試劑盒(杭州聯(lián)科)，Dual-Glo熒光素酶測定系統(tǒng)(美國Promega)。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 A549細胞培養(yǎng)于37℃、含5% CO2的環(huán)境中，與含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基一起生長。A549細胞以5×105個/孔接種在6孔板中，培養(yǎng)至80%融合，根據(jù)Lipofectamine 2000試劑的操作說明，在A549細胞中轉(zhuǎn)染si-NC(si-NC組)、si-circ_0008035(si-circ_0008035組)、miR-NC(miR-NC組)、miR-188-3p mimics(miR-188-3p組)，或共轉(zhuǎn)染si-circ_0008035和anti-miR-188-3p(si-circ_0008035+anti-miR-188-3p組)。另設正常培養(yǎng)的細胞為對照(con組)。轉(zhuǎn)染48 h后，將轉(zhuǎn)染成功的A549細胞用于后續(xù)檢測。

1.4 實時定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)circ_0008035和表達 肺癌組織和A549細胞在TRIzol試劑中裂解，以提取總RNA。在NanoDrop 2000c分光光度計上測量RNA濃度后，用PrimeScrip RT試劑盒合成cDNA。然后使用AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix在ABI 7500 PCR系統(tǒng)上確定circRNA與miRNA相對表達，并使用2-ΔΔCt方法進行計算。GAPDH或U6被用作內(nèi)參。引物序列如下：circ_0008035：5’-CTACCAGCCAAACACCGCT-3’和R：5’-TCCAGGAATCTGAAGGACCCA-3’；miR-188-3p：F：5’-CUCCCACATGCAGGG-3’和R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；GAPDH：F：5’-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3’和R：5’-ACGTCGCACTTCATGATCGAG-3’；U6：F：5’-CTCGCTTCGGCACA-3’和R：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.5 Western blot 在RIPA緩沖液中分離A549細胞蛋白，定量后將40 μg樣品在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜在5%的牛血清白蛋白中封閉1 h，然后與HMGB2(1∶2 000稀釋)、GAPDH(1∶3 000稀釋)一抗孵育過夜，與辣根過氧化物酶標記的IgG二抗(1∶5 000稀釋)孵育2 h。印跡暴露于增強的化學發(fā)光后，以GAPDH為歸一化參比，通過Image J分析印跡。

1.6 細胞計數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8，CCK-8)細胞增殖測定 將A549細胞重懸并以1×104個/孔接種在96孔板中。細胞鋪板后，在48 h向每個孔中加入10 μl CCK-8溶液，然后在5% CO2和37℃下孵育2 h。使用BioTek酶標儀測量450 nm處的吸光度OD值。使用以下公式計算抑制率：100%-(空白組OD值/試驗組OD值)×100%。

1.7 平板克隆形成試驗 將A549細胞(每孔200個細胞)接種到6孔板，在5% CO2和37℃下與完全培養(yǎng)基一起孵育2周，直到出現(xiàn)明顯的細胞克隆。用PBS小心洗滌細胞，4%多聚甲醛固定15 min，用吉姆薩溶液染色15 min，用自來水洗滌并風干，顯微鏡下計數(shù)克隆形成數(shù)。

1.8 流式細胞術 根據(jù)說明書，將2×105個A549細胞在黑暗中用Annexin V-FITC和PI染色15 min。流式細胞儀用于檢測細胞凋亡率。

1.9 雙熒光素酶活性檢測 在Circular RNA Interactome軟件中預測circ_0008035和miR-188-3p的靶向結(jié)合，targetscan軟件中預測miR-188-3p和HMGB2的靶向結(jié)合。通過在pmir-GLO載體中插入含有miR-188-3p互補位點的野生型(WT)circ_0008035或HMGB2序列來構建WT-circ_0008035或WT-HMGB2熒光素酶報告載體。通過突變miR-188-3p的互補位點，構建突變型(MUT)-circ_0008035或MUT-HMGB2熒光素酶報告載體。將這些載體與miR-188-3p mimics或miR-NC一起轉(zhuǎn)染到A549細胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，使用Dual-Glo熒光素酶測定系統(tǒng)測量熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 circ_0008035和miR-188-3p在肺癌組織中的表達 肺癌組織中circ_0008035表達較癌旁組織增加，miR-188-3p表達較癌旁組織減少(P<0.05)。見表1。

表1 circ_0008035和miR-188-3p在肺癌組織中的表達

2.2 沉默circ_0008035對A549增殖凋亡的影響 在A549細胞中沉默circ_0008035后，與con組或si-NC組相比，si-circ_0008035組circ_0008035表達減少，miR-188-3p表達增加，HMGB2蛋白表達減少，細胞抑制率與凋亡率增加，克隆形成數(shù)減少(P<0.05)；而這些指標在con組和si-NC組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1，表2。

圖1 沉默circ_0008035對A549凋亡及HMGB2蛋白表達的影響

表2 沉默circ_0008035抑制A549增殖誘導凋亡

2.3 miR-188-3p對A549增殖凋亡的影響 在A549細胞中過表達miR-188-3p后，與con組或miR-NC組相比，miR-188-3p組miR-188-3p表達增加，HMGB2蛋白表達減少，細胞抑制率與凋亡率增加，克隆形成數(shù)減少(P<0.05)；而這些指標在con組和miR-NC組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2，表3。

表3 miR-188-3p抑制A549增殖誘導凋亡

圖2 miR-188-3p對A549凋亡及HMGB2蛋白表達的影響

2.4 circ_0008035、miR-188-3p和HMGB2靶向關系的驗證 預測軟件Circular RNA Interactome和targetscan對circ_0008035與miR-188-3p、miR-188-3p與HMGB2靶向結(jié)合的示意圖。miR-188-3p組WT-circ_0008035、WT-HMGB2熒光素酶活性均低于miR-NC組(P<0.05)，2組MUT-circ_0008035、MUT-HMGB2熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4，圖3。

表4 雙熒光素酶報告實驗

圖3 circ_0008035和miR-188-3p的互補序列及miR-188-3p和HMGB2的互補序列

2.5 抑制miR-188-3p對沉默circ_0008035處理的A549增殖凋亡的影響 si-circ_0008035組miR-188-3p表達比con組高，HMGB2蛋白表達比con組低，細胞抑制率與凋亡率比con組多，克隆形成數(shù)比con組少(P<0.05)；si-circ_0008035+anti-miR-188-3p組miR-188-3p表達比si-circ_0008035組低，HMGB2蛋白表達比si-circ_0008035組高，細胞抑制率與凋亡率比si-circ_0008035組少，克隆形成數(shù)比si-circ_0008035組多(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 抑制miR-188-3p可逆轉(zhuǎn)沉默circ_0008035對A549凋亡及HMGB2蛋白表達的檢測

表5 抑制miR-188-3p可逆轉(zhuǎn)沉默circ_0008035對A549增殖的抑制凋亡的誘導作用

3 討論

最近幾十年中，越來越多的報道指出circRNA對癌癥進展的重要影響[11]。某些circRNA表達失調(diào)，并與肺癌中的細胞行為和腫瘤發(fā)生有關。例如，hsa_circ_0012673通過miR-320a/LIMK18521軸促進肺癌細胞增殖和侵襲[12]。CircRNA BIRC6通過海綿miR-145促進非小細胞肺癌細胞進展[13]。hsa_circ_0008035在骨肉瘤患者血清、組織和細胞中高表達，沉默hsa_circRNA_0008035通過負調(diào)節(jié)miR-375的表達阻止骨肉瘤細胞的生長和遷移[14]。circ_0008035在胃癌組織和細胞中上調(diào)，circ_0008035沉默抑制胃癌細胞增殖，誘導細胞凋亡[15]。此外，circ_0008035充當miR-599的海綿上調(diào)EIF4A1促進胃癌進展。而關于circ_0008035對肺癌的影響尚未可知。本研究顯示，circ_0008035在肺癌組織中表達升高，沉默circ_0008035使A549細胞增殖抑制率和凋亡率增加，克隆形成數(shù)減少，說明沉默circ_0008035可抑制肺癌細胞增殖，并誘導其凋亡，與前人[15]研究吻合。

ceRNA機制表明circRNA與miRNA競爭性結(jié)合以減輕對miRNA靶基因的抑制，從而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)基因的表達[16]。circRNA作為ceRNA參與生物學過程，例如腫瘤細胞的增殖，凋亡，侵襲和遷移[17]。Yao等[9]指出，circGFRA1通過使miR-188-3p海綿化來促進非小細胞肺癌細胞的增殖。Gao等[18]揭示circ_0109291通過使miR-188-3p海綿化以增加ABCB1表達來促進口腔鱗狀細胞癌的順鉑耐藥性。本研究的生物信息學預測到circ_0008035可能與miR-188-3p靶向結(jié)合，這暗示circ_0008035可能充當ceRNA。當沉默circ_0008035時，miR-188-3p的表達上調(diào)。我們還通過雙熒光素酶報告基因分析驗證了circ_0008035與miR-188-3p的相互作用。同時，miR-188-3p在胰腺癌[19]、肝細胞癌等[20]多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)下調(diào)，可以減緩乳腺癌MCF-7細胞的增殖、遷移和侵襲[21]。本研究顯示，miR-188-3p在肺癌中表達下調(diào)，起腫瘤抑制劑的作用，因為過表達miR-188-3p促進肺癌細胞凋亡和抑制增殖。此外，抑制miR-188-3p可逆轉(zhuǎn)沉默circ_0008035對A549細胞增殖的抑制及其對細胞凋亡的誘導作用，結(jié)果證明circ_0008035充當miR-188-3p的海綿。

HMGB2被認為是非小細胞肺癌的癌基因，在非小細胞肺癌腫瘤組織中的表達增加[22]。HMGB2在宮頸癌中高表達，可能通過激活AKT信號通路促進宮頸癌細胞增殖[23]。miR-329可以通過靶向下調(diào)HMGB2來抑制黑色素瘤的進展[24]。HMGB2可以作為miR-874的靶點參與胃癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移[25]。本研究發(fā)現(xiàn)HMGB2是miR-188-3p的靶基因。且HMGB2表達被過表達miR-188-3p所抑制，被沉默circ_0008035所抑制。且沉默circ_0008035對A549細胞HMGB2表達的抑制作用被抑制miR-188-3p逆轉(zhuǎn)。這些發(fā)現(xiàn)表明，circ_0008035通過海綿miR-188-3p上調(diào)HMGB2表達，來促進肺癌進程。

綜上所述，新型circ_0008035/miR-188-3p/HMGB2軸在肺癌的發(fā)生中起重要作用。circ_0008035充當ceRNA，通過海綿miR-188-3p調(diào)節(jié)HMGB2影響肺癌細胞的增殖和凋亡?？梢奵irc_0008035可能是肺癌的潛在診斷生物標志物和治療靶標。