袁雯 楊昕宇 楊華

糖尿病性心肌病屬于糖尿病并發(fā)癥之一，是指糖尿病引起的一種心肌病變，可誘發(fā)心肌性壞死進(jìn)而引起心力衰竭、心源性休克等最終造成患者死亡，氧化應(yīng)激是促使糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的重要原因之一，同時(shí)蛋白與脂質(zhì)過氧化等誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡是造成糖尿病性心肌病的重要原因[1]。已有研究報(bào)道指出部分中藥具有抗炎、抗氧化等作用，還可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞生長(zhǎng)及抑制炎性因子相關(guān)基因的表達(dá)[2]。蛇床子素是天然植物蛇床子萃取的單體，其具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用外，還可抑制炎性反應(yīng)而減輕大鼠心臟缺血再灌注損傷[3]。但蛇床子素與糖尿病性心肌病相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少。環(huán)狀RNA(circRNA)在糖尿病中表達(dá)異常，并可能參與糖尿病并發(fā)癥形成過程，已有研究表明circ_0084043在糖尿病性視網(wǎng)膜病變中表達(dá)水平升高，并可通過充當(dāng)miR-140-3p的海綿分子而促進(jìn)糖尿病性視網(wǎng)膜病變的發(fā)展[4]。生物信息學(xué)分析顯示circ_0084043與miR-338-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，研究表明miR-338-3p在高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)水平降低，circVEGFC通過調(diào)控miR-338-3p/HIF-1α/VEGFA軸促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[5]。但circ_0084043/miR-338-3p分子軸是否可介導(dǎo)蛇床子素對(duì)糖尿病性心肌病的治療過程尚未可知。因此，本研究采用高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9C2建立細(xì)胞損傷模型，探討蛇床子素是否可通過調(diào)控circ_0084043/miR-338-3p影響高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖、凋亡及氧化應(yīng)激。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 蛇床子素購(gòu)自長(zhǎng)沙上禾生物；心肌細(xì)胞H9C2購(gòu)自美國(guó)ATCC；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco；胎牛血清購(gòu)自上海玉博生物；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher；LipofectamineTM2000、凋亡檢測(cè)試劑盒、MTT試劑購(gòu)自北京索萊寶；MDA、SOD檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠Bax、Bcl-2抗體購(gòu)自美國(guó)CST；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組:H9C2細(xì)胞培養(yǎng)于含有30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)24 h，記為高糖組(HG組)。H9C2細(xì)胞培養(yǎng)于含有5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)24 h，記為正常糖組(NC組)。H9C2細(xì)胞分別加入含有不同濃度(10 nmol/L、33 nmol/L、100 nmol/L)的蛇床子素與30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)24 h，分別記為HG+蛇床子素低劑量組、HG+蛇床子素中劑量組、HG+蛇床子素高劑量組。si-NC、si-circ_0084043分別轉(zhuǎn)染入H9C2細(xì)胞后加入含有30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)24 h，分別記為HG+si-NC組、HG+si-circ_0084043組。pcDNA、pcDNA-circ_0084043分別轉(zhuǎn)染入H9C2細(xì)胞后加入含有100 nmol/L蛇床子素與30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)24 h，分別記為HG+蛇床子素高劑量+pcDNA組、HG+蛇床子素高劑量+pcDNA-circ_0084043組。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中circ_0084043、miR-338-3p的表達(dá)水平:根據(jù)RNA試劑盒說明書提取各組H9C2細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA濃度后置于-80℃冰箱內(nèi)保存。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物0.8 μl，cDNA 2 μl，ddH2O補(bǔ)足體系至20 μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循環(huán)。circ_0084043以GAPDH為內(nèi)參，miR-338-3p以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算circ_0084043、miR-338-3p相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖:收集各組H9C2細(xì)胞(1×105個(gè)/ml)接種于96孔板(150 μl/孔)，分別加入MTT溶液(20 μl/孔)與DMSO(150 μl/孔)，室溫避光孵育5 min后檢測(cè)細(xì)胞吸光度值(OD值)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率:收集各組H9C2細(xì)胞加入預(yù)冷PBS洗滌，棄上清后將500 μl結(jié)合緩沖液加入細(xì)胞沉淀中，分別加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，振蕩搖晃孵育10 min后檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、SOD的水平:采用反復(fù)凍融法裂解各組H9C2細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞中MDA、SOD的水平。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)circ_0084043與miR-338-3p的靶向關(guān)系:Circular RNA Interactome預(yù)測(cè)顯示circ_0084043與miR-338-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，分別構(gòu)建野生型載體WT-circ_0084043與突變型載體MUT-circ_0084043，miR-NC、miR-338-3p mimics分別與WT-circ_0084043、MUT-circ_0084043共轉(zhuǎn)染入H9C2細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞并檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.7 Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá):提取各組H9C2細(xì)胞總蛋白后檢測(cè)蛋白濃度，取50 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃條件下孵育一抗稀釋液(1∶1 000)過夜，TBST洗滌，室溫條件下孵育二抗稀釋液(1∶2 000)1 h，滴加ECL，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 蛇床子素對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2損傷的影響 與NC組比較，HG組circ_0084043的表達(dá)水平升高(P<0.05)，miR-338-3p的表達(dá)水平降低(P<0.05)，細(xì)胞活力降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；與HG組比較，HG+蛇床子素低劑量組、HG+蛇床子素中劑量組、HG+蛇床子素高劑量組circ_0084043的表達(dá)水平降低(P<0.05)，miR-338-3p的表達(dá)水平升高(P<0.05)，細(xì)胞活力升高(P<0.05)，凋亡率降低(P<0.05)，Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，且不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 蛇床子素對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2凋亡的影響;A 蛇床子素對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響;B 蛇床子素可抑制高糖誘導(dǎo)的H9C2凋亡

表1 不同濃度蛇床子素對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2損傷的影響

2.2 蛇床子素對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2氧化應(yīng)激的影響 與NC組比較，HG組MDA的水平升高(P<0.05)，SOD的活性降低(P<0.05)；與HG組比較，HG+蛇床子素低劑量組、HG+蛇床子素中劑量組、HG+蛇床子素高劑量組MDA的水平降低(P<0.05)，SOD的活性升高(P<0.05)，且不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同濃度蛇床子素對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2氧化應(yīng)激的影響

2.3 干擾circ_0084043對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2損傷的影響 與HG+si-NC組比較，HG+si-circ_0084043組miR-338-3p的表達(dá)升高(P<0.05)，細(xì)胞活力升高(P<0.05)，凋亡率降低(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，Bax蛋白降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白升高(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 干擾circ_0084043對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2凋亡的影響;A 干擾circ_0084043可抑制高糖誘導(dǎo)的H9C2凋亡;B 干擾circ_0084043對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

表3 干擾circ_0084043對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2損傷的影響

2.4 circ_0084043可逆轉(zhuǎn)蛇床子素對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2損傷的影響 與HG+蛇床子素高劑量+pcDNA組比較，HG+蛇床子素高劑量+pcDNA-circ_0084043組細(xì)胞的活力降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，MDA的水平升高(P<0.05)，SOD的活性降低(P<0.05)，Bax蛋白水平明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 circ_0084043可逆轉(zhuǎn)蛇床子素對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2凋亡的影響;A circ_0084043可逆轉(zhuǎn)蛇床子素對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2凋亡的影響;B circ_0084043可逆轉(zhuǎn)蛇床子素對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

表4 circ_0084043可逆轉(zhuǎn)蛇床子素對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2損傷的影響

2.5 circ_0084043靶向miR-338-3p Circular RNA Interactome預(yù)測(cè)顯示circ_0084043與miR-338-3p存在結(jié)合位點(diǎn)。miR-338-3p過表達(dá)可降低野生型載體WT-circ_0084043的熒光素酶活性(P<0.05)，而對(duì)突變型載體MUT-circ_0084043的熒光素酶活性無明顯影響。見圖4，表5。

圖4 circ_0084043和miR-338-3p的互補(bǔ)序列

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

3 討論

目前糖尿病性心肌病的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，體內(nèi)持續(xù)處于高糖狀態(tài)可促進(jìn)炎癥、氧化應(yīng)激等反應(yīng)的發(fā)生而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，部分中藥的活性成分可減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，但其作用途徑、作用靶點(diǎn)相關(guān)研究較少[6]。circRNA在糖尿病心肌病中表達(dá)異常，并可能作為早期診斷及治療糖尿病心肌病的生物標(biāo)記物[7]。但circRNA是否可作為中藥治療糖尿病性心肌病的潛在靶點(diǎn)尚未可知。

蛇床子素是從蛇床果實(shí)中提取，具有抗炎、抗癌等作用，且研究表明蛇床子素可減輕類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠的軟骨細(xì)胞損傷[8]。蛇床子素可減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷，并可抑制ROS介導(dǎo)的線粒體凋亡[9]。但蛇床子素對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響尚未可知。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力與Bcl-2蛋白水平降低，凋亡率與Bax蛋白水平升高，與報(bào)道結(jié)果[10]相似，提示成功建立糖尿病性心肌病心肌細(xì)胞損傷模型。本研究分析顯示，蛇床子素處理后高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力升高，凋亡率降低，呈劑量依賴性，提示蛇床子素可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖而抑制細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中MDA的水平升高，SOD的活性降低，與報(bào)道結(jié)果[11]相似，而蛇床子素處理后高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中MDA水平降低，SOD的活性升高，且呈劑量依賴性，提示蛇床子素可明顯抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激。

本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中circ_0084043的表達(dá)升高，而蛇床子素處理后高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中circ_0084043的表達(dá)降低，且隨著藥物濃度增加而明顯降低，提示蛇床子素可能通過下調(diào)circ_0084043的表達(dá)發(fā)揮作用。研究表明circ_0084043在黑素瘤中表達(dá)水平升高，并可能發(fā)揮癌基因作用[12]。本研究顯示干擾circ_0084043表達(dá)后高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力升高，凋亡率降低，MDA水平降低，SOD活性升高，提示干擾circ_0084043表達(dá)可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖而抑制細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激。為探究circ_0084043在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制，本研究證實(shí)circ_0084043可充當(dāng)miR-338-3p的海綿分子而負(fù)向調(diào)控miR-338-3p的表達(dá)。有研究表明miR-338-3p在妊娠高血壓患者外周血和胎盤中的表達(dá)水平升高[13]。miR-338-3p在脂多糖誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，circ_0038467可通過充當(dāng)miR-338-3p的海綿分子而促進(jìn)細(xì)胞損傷[14]。本研究顯示，高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-338-3p的表達(dá)水平降低，蛇床子素可明顯促進(jìn)miR-338-3p的表達(dá)，且呈劑量依賴性，而circ_0084043過表達(dá)可通過抑制miR-338-3p的表達(dá)而明顯逆轉(zhuǎn)蛇床子素對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖、凋亡及氧化應(yīng)激的作用。

綜上所述，高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中circ_0084043的表達(dá)水平升高，miR-338-3p的表達(dá)水平降低，蛇床子素可抑制circ_0084043的表達(dá)而促進(jìn)miR-338-3p的表達(dá)，并可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖而抑制細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激，circ_0084043過表達(dá)可拮抗蛇床子素對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用，本研究證實(shí)蛇床子素可通過調(diào)控circ_0084043/miR-338-3p分子軸而減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。