劉志紅 孟令振 劉靜 魯明 王瑞英

2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)占所有糖尿病的90%[1]，是胰島素抵抗和胰島素缺乏的結(jié)果，其中肝臟胰島素抵抗是T2DM發(fā)病機制的重要組成部分[2]。目前導致肝臟胰島素抵抗的發(fā)病機制仍有爭議，不同的假設將因果關(guān)系歸因于內(nèi)臟脂肪、脂肪因子、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和炎癥等[3]。雖然肝臟胰島素抵抗的病理生理學是復雜和多因素的，但研究特定的分子機制可能為改善糖尿病肝臟胰島素抵抗提供新的治療策略。近年來，大量的基因芯片數(shù)據(jù)可以從公共數(shù)據(jù)儲存庫中免費獲得，越來越多的研究者投入巨大的精力挖掘數(shù)據(jù)集中有價值的信息用于疾病的研究[4,5]，為糖尿病的診斷、治療提供新的生物標志物。本研究通過生物信息學手段，從GEO數(shù)據(jù)庫中尋找到關(guān)于T2DM肝臟的基因芯片數(shù)據(jù)集同時結(jié)合CTD數(shù)據(jù)庫的IR相關(guān)基因，分析與肝臟IR差異表達基因(DEGs)及其通路，以期尋找到改善IR的關(guān)鍵靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 通過檢索詞“type 2 diabetes”和“hepatic”在 GEO 數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載數(shù)據(jù)集 GSE15653，該芯片數(shù)據(jù)由Pihlajam?ki等[6]于 2009年4月提交，以GPL96(HG-U133A)Affymetrix Human Genome U133A Array為研究平臺，分析4例2型糖尿病(GSM391707-GSM391710)及5例正常(GSM391693-GSM391697)肝臟組織的基因表達矩陣。

1.2 肝臟胰島素抵抗差異基因篩選與可視化 利用 GEO2R在線分析工具對 GSE15653數(shù)據(jù)集樣本進行分組并篩選出DEGs，以P值<0.01以及l(fā)ogFC絕對值≥1為篩選條件。使用ggplot2進行差異基因的可視化[7]。同時從CTD數(shù)據(jù)庫中篩選出36 787個肝臟IR相關(guān)基因，CTD數(shù)據(jù)庫[8]是研究人員為促進了解環(huán)境化合物對人類健康的影響構(gòu)建的，為全世界的科研人員提供了集中、綜合的各種不同類型分子以及來自各種生物體的毒理學數(shù)據(jù)。應用韋恩圖可視化兩基因集的交集基因IR-DEGs。

1.3 功能富集分析 使用R軟件包clusterProfiler[9]對IR-DEGs進行基因本體論(GO)分析和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫(KEGG)分析，同時以P<0.05為篩選條件。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡構(gòu)建及篩選關(guān)鍵基因 將上面得到的 IR-DEGs列表提交到 STRING在線數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，設置最小連接評分為0.9構(gòu)建蛋白質(zhì)互相作用(PPI)網(wǎng)絡圖。使用 Cytoscape 3.8.0的 cytoHubba插件里的MCC算法篩選PPI網(wǎng)絡里排名靠前的 10個基因作為關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 肝臟胰島素抵抗差異基因 根據(jù)篩選條件，從GSE15653數(shù)據(jù)集篩選出1 233個DEGs。從CTD數(shù)據(jù)庫下載IR相關(guān)基因共36 786個基因，利用Vene與GSE15653的差異基因取交集后共得到1 197個IR-DEGs，其中在GSE15653上調(diào)IR-DEGs 352 個，下調(diào)DEGs 845個。見圖1。

圖1 DEGs 表達譜火山圖

2.2 GO 及KEGG 分析 將1 197個IR-DEGs進行GO 富集分析，GO 富集分析由生物過程(BP)、分子功能(MF)、細胞組成(CC)3個部分組成。根據(jù) P 值排序，KEGG 通路富集分析中，DEGs 富集于磷酸戊糖途徑、ErbB信號通路、MAPK信號通路、胰島素信號通路等。見表1、2，圖2。

圖2 IR-DEGs的KEGG分析

表1 KEGG 分析

表2 GO分析

2.3 PPI 網(wǎng)絡和關(guān)鍵基因 將1 197個DEGs提交到 STRING數(shù)據(jù)庫，形成PPI 網(wǎng)絡圖。使用Cytoscape 軟件選取cytoHubb的MCC 算法得到10 個關(guān)鍵基因:MAPK3、SRC、MAPK8、CCNB1、DLGAP5、ASPM、KRAS、NRAS、NUSAP1、BIRC5。見圖3、4。

圖3 PPI 網(wǎng)絡圖

3 討論

胰島素抵抗是指胰島素的靶組織和細胞對其敏感性降低，是機體糖代謝紊亂的主要原因，因此對于T2DM的治療大多關(guān)注于如何改善IR，肝臟是胰島素在機體內(nèi)起作用的重要靶器官，調(diào)控糖原的合成和糖異生的進程。肝臟IR將引起糖脂代謝紊亂以及其他病理過程的發(fā)生，因此本研究利用T2DM患者和正常人群肝臟組織樣本的基因數(shù)據(jù)集，通過 GEO2R鑒定與T2DM相關(guān)上調(diào)、下調(diào)DEGs，之后與CTD數(shù)據(jù)庫的IR基因取交集，得到1 197個肝臟IR-DEGs進行分析，尋找治療肝臟IR的關(guān)鍵基因。

圖4 關(guān)鍵基因；節(jié)點顏色越深代表 MCC 分值越高

GO分析發(fā)現(xiàn)，肝臟IR-DEGs主要富集于類固醇激素反應、Hsp90 蛋白結(jié)合、熱休克蛋白綁定等。類固醇激素中的糖皮質(zhì)激素可以導致肝臟IR增加[10]，體內(nèi)糖皮質(zhì)激素增加會升高乙酰輔酶A 羧化酶和脂肪酸合成酶的水平導致肝臟細胞脂質(zhì)變性和沉積，促進炎性因子的釋放，阻礙胰島素信號通路，引起IR[11]。同時糖皮質(zhì)激素可以刺激磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶基因的表達，導致肝糖異生增加，加重IR。熱休克蛋白(HSPs)是一種伴侶蛋白，屬于幫助受損分子恢復其功能構(gòu)象的多肽家族。機體合成熱休克蛋白是為了應對不同的應激源(熱休克、低體溫、缺氧、自由基、缺血、乙醇、紫外線輻射、病毒感染等)刺激。熱休克蛋白通過減少氧化作用保護蛋白質(zhì)、脂類和核酸免受損害，因此具有細胞保護作用，同時它們還調(diào)節(jié)細胞功能和基因表達，并有助于蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。最重要的HSP家族有HSP40、HSP60、HSP70、HSP90-kDa，以及小的熱休克蛋白。研究發(fā)現(xiàn)DIO小鼠中的Hsp90β敲低可逆轉(zhuǎn)IR并改善葡萄糖耐量[12]，在糖尿病db/db小鼠模型中長期使用HSP90抑制劑可抑制c-Jun氨基末端蛋白激酶1(JNK1)磷酸化逆轉(zhuǎn)高血糖癥，胰島素敏感性得到改善[13]。研究發(fā)現(xiàn)HSP70在糖尿病患者的血液循環(huán)中升高，并且與疾病的慢性程度呈正相關(guān)[14]。Krause等[15]認為eHSP70/iHSP70比值可能是觸發(fā)導致IR和T2DM發(fā)展的慢性促炎狀態(tài)的決定性因素。但有研究發(fā)現(xiàn)HSP70對IR狀態(tài)有有益作用，能夠保護細胞免受氧化應激損傷、炎癥和凋亡的損害[16]。Ohno等[17]也證實iHSP70 能夠改善IR、延緩甚至逆轉(zhuǎn)T2DM 疾病進程，機制與阻斷JNKs抑制細胞凋亡而保護細胞相關(guān)。

KEGG分析中磷脂酰肌醇-3激酶(1-phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(Protein kinase B,Akt)通路是主要的胰島素信號通路[18]。胰島素與胰島素受體結(jié)合后激活胰島素受體底物(IRS)分子，IRS隨后與PI3K結(jié)合，磷酸化Akt 增加，活化的Akt一方面促使糖原合成酶激酶-3磷酸化[19]，加速肝糖原合成; 活化的 Akt同時激活Forkhead 轉(zhuǎn)錄因子 1的磷酸化，抑制肝糖異生關(guān)鍵酶的水平，降低肝糖異生[20]; 活化的Akt 也促進葡萄糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶，加速肝臟葡萄糖的利用。在肝臟IR狀態(tài)時,激活的IRS含量減少,PI3K活性下降,導致IRS/PI3K/Akt通路作用減弱,胰島素調(diào)節(jié)糖脂代謝的信號減弱,導致代謝紊亂，加重肝臟IR，形成惡性循環(huán)。因此胰島素信號通路在肝臟胰島素抵抗過程中起至關(guān)重要的作用。腺苷酸活化蛋白激酶(MAPK)信號通路在非胰島素依賴的葡萄糖代謝中發(fā)揮重要作用[21]，MAPK 通過磷酸化靶蛋白來調(diào)控信號通路，促進脂肪酸氧化、抑制肝臟對糖的輸出、降低脂肪生成和三酰甘油的合成，從而發(fā)揮能量代謝。MAPK可通過上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運載體-4的表達，促進糖的吸收和利用，增加胰島素受體的敏感性，改善IR[22]。

為了進一步取得與肝臟IR相關(guān)度較高的關(guān)鍵基因，本研究應用PPI網(wǎng)絡篩選出MAPK3、SRC、MAPK8、CCNB1、DLGAP5、ASPM、KRAS、NRAS、NUSAP1、BIRC5這10個關(guān)鍵基因。SRC是一種原癌基因酪氨酸蛋白激酶，在細胞增殖、分化等細胞過程中發(fā)揮作用。Feng等[23]發(fā)現(xiàn)棕櫚酸酯通過下調(diào)C2C12 肌管中SRC介導的Akt磷酸化導致IR。同時SRC1已被鑒定為核激素受體和其他轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄輔激活因子，SRC1基因缺失增加DKO小鼠IRS1水平，從而引起葡萄糖攝取增加和改善胰島素敏感性，因此SRC1不僅是肥胖的潛在治療靶點，也是糖尿病的潛在治療靶點[24]。既往研究也發(fā)現(xiàn)氯沙坦通過上調(diào)SRC磷酸化水平，抑制對接蛋白1表達，增加Akt及其下游160 kDa Akt底物(AS160)的磷酸化水平，激活葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4的向質(zhì)膜轉(zhuǎn)運，增加了葡萄糖攝取，改善棕櫚酸誘導的脂肪細胞IR[25]。MAPK8被稱為c-Jun NH2-terminal kinase 1(JNK1)，研究發(fā)現(xiàn)，肥胖患者中MAPK8 mRNA水平顯著升高[26]，參與肥胖誘導IR的機制，高脂肪飲食可導致小鼠JNK1信號通路激活、IR和肥胖[27]。

綜上所述，關(guān)鍵基因MAPK3、CCNB1、DLGAP5、ASPM、KRAS、NRAS、NUSAP1、BIRC5在肝臟IR中的作用尚不清楚，這些關(guān)鍵基因有可能成為肝臟IR早期診斷、治療的分子標志物，尚需后續(xù)進一步研究。