林方梁 張杰 曾麗霞 楊正濤 王東

口腔鱗癌是臨床口腔科常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率呈逐年升高的趨勢。臨床主要采用手術、放療、化療等方式進行治療，但有數(shù)據(jù)顯示口腔鱗癌患者復發(fā)率較高且生存率較低[1,2]。靶向治療方法開辟了口腔癌治療的新途徑[3]。有研究報道longnon-codingRNA，lncRNA和微小RNA(microRNA，miRNA)均參與調控口腔鱗癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等多種生物學過程，可將其作為口腔鱗癌早期診斷、治療和預后的分子生物學標志[4-7]。但lncRNAFOXD2-AS1是否可通過調控miR-1299表達從而影響口腔鱗癌細胞增殖及凋亡，目前筆者查閱文獻后發(fā)現(xiàn)仍尚未可知。因此本實驗研究lncRNAFOXD2-AS1靶向miR-1299調控口腔鱗癌細胞增殖和誘導凋亡的體外研究，為揭示口腔鱗癌發(fā)生及發(fā)展的分子機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 口腔鱗癌細胞CAL27、SCC-090、HSC-3購自上海冠導生物工程有限公司；正常人口腔角質細胞NHOK購自上海賓穗生物科技有限公司；qPCR試劑盒購自上?？道噬锟萍加邢薰?；CCK-8試劑盒購自杭州仟諾生物科技有限公司；BCA試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell小室、Matrigel膠購自美國BD公司；AnnexinV-FITC/PI試劑盒購自北京博爾邁生物技術有限公司。

1.2 細胞處理與分組 人口腔鱗癌細胞株CAL27、SCC-090、HSC-3和正常人口腔角質細胞NHOK在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，條件37℃、5% CO2；取對數(shù)生長期細胞CAL27，將FOXD2-AS1干擾表達載體、FOXD2-AS1干擾對照載體、FOXD2-AS1過表達載體、FOXD2-AS1過表達對照載體、miR-1299模擬物、miR-1299模擬物對照質粒分別轉染至細胞中，分別記為si-NC組、si-FOXD2-AS1組、pcDNA-NC組、pcDNA-FOXD2-AS1組、miR-NC組、miR-1299組；將FOXD2-AS1干擾表達載體分別與miR-1299抑制劑、miR-1299抑制劑對照質粒轉染至細胞中，記為anti-miR-NC+si-FOXD2-AS1組、anti-miR-1299+si-FOXD2-AS1組。

1.3 qPCR檢測lncRNA FOXD2-AS1和miR-1299的表達 提取各組細胞的總RNA，利用RNA試劑盒合成cDNA，根據(jù)qPCR試劑盒加入試劑，并在PCR儀上進行熒光定量。lncRNA FOXD2-AS1和miR-1299分別以GAPDH和U6為內參。lncRNA FOXD2-AS1上游引物：5’-CCGCGTAAGCCTCATAGAAG-3’，下游引物：5’-GGGAGTAGGGTGAGGAAAGG-3’；U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；miR-1299上游引物：5’-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3’，下游引物：5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAG-3’；GAPDH上游引物：5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’，下游引物：5’-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3’。引物由上海生工生物工程公司合成。lncRNA FOXD2-AS1和miR-1299相對表達量用2-△△Ct法計算。

1.4 CCK-8檢測細胞增殖能力 各組細胞培養(yǎng)48 h后，制成密度為1×104個/ml的單細胞懸液，接種于96孔板中，加入10 μl CCK-8試劑/每孔，37℃孵育2 h，酶標儀檢測每孔450 nm處光密度值(OD)。將OD值轉換成細胞存活率。

1.5 Annexin V-FITC和PI染色實驗檢測細胞凋亡 各組細胞培養(yǎng)48 h后，以1×105個/孔接種于96孔板中，調整細胞密度至1×106個/ml，1×結合緩沖液重懸，分別加入10 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI。流式細胞儀檢測凋亡情況。

1.6 Western blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3、β-catenin蛋白表達 各組細胞培養(yǎng)48 h后，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳后，用濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上。室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜；加入二抗(1∶2 000稀釋)，室溫孵育2 h，放入ECL顯色液中顯色15 min，應用Image Pro Plus軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.7 雙熒光素酶報告實驗檢測lncRNA FOXD2-AS1對miR-1299的靶向作用 構建野生型和突變型基因靶點熒光素酶表達載體WT-FOXD2-AS1和MUT-FOXD2-AS1，用LipofectamineTM2000將WT-FOXD2-AS1和MUT-FOXD2-AS1分別與miR-NC和miR-1299共轉染至CAL27細胞中，檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 正?？谇唤琴|細胞與口腔鱗癌細胞中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1和miR-1299的表達 與正常人口腔角質細胞NHOK相比，口腔鱗癌細胞CAL27、SCC-090、HSC-3中l(wèi)ncRNAFOXD2-AS1表達水平顯著升高，miR-1299表達水平顯著降低(P<0.05)。選擇差異最明顯的CAL27細胞用于后續(xù)實驗。見表1。

表1 正?？谇唤琴|細胞與口腔鱗癌細胞系中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1和miR-1299的表達情

2.2 低表達lncRNA FOXD2-AS1對CAL27細胞增殖和凋亡的影響 與si-NC組比較，si-FOXD2-AS1組細胞中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1表達水平顯著降低，CyclinD1表達水平、細胞存活率顯著降低，Cleaved-caspase-3表達水平、細胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 低表達lncRNA FOXD2-AS1對CAL27細胞增殖和凋亡的影響

圖1 低表達lncRNA FOXD2-AS1對CAL27細胞增殖和凋亡的影響；A 細胞凋亡圖；B 蛋白表達圖

2.3 高表達miR-1299對CAL27細胞增殖和凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-1299組細胞中miR-1299表達水平顯著升高，CyclinD1表達水平、細胞存活率顯著降低，Cleaved-caspase-3表達水平、細胞凋亡率顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 高表達miR-1299對CAL27細胞增殖和凋亡的影響

圖2 蛋白表達圖

2.4 lncRNA FOXD2-AS1與 miR-1299結合位點 結果顯示lncRNA FOXD2-AS1和miR-1299有靶向關系。與miR-NC組相比，細胞轉染W(wǎng)T-FOXD2-AS1后，miR-1299表達水平顯著降低(P<0.05)；細胞轉染MUT-FOXD2-AS1后，miR-1299表達水平無顯著變化(P>0.05)。與si-NC組相比，si-FOXD2-AS1組miR-1299表達顯著升高(P<0.05)，與pcDNA-NC組相比，pcDNA-FOXD2-AS1組miR-1299表達顯著降低(P<0.05)。見表4、5，圖3。

表4 雙熒光素酶報告實驗

表5 qPCR檢測miR-1299的表達

圖3 lncRNA FOXD2-AS1和miR-1299結合位點圖

2.5 低表達miR-1299可以逆轉FOXD2-AS1低表達對口腔鱗癌細胞CAL27增殖和凋亡的影響 與anti-miR-NC+si-FOXD2-AS1組相比，anti-miR-1299+si-FOXD2-AS1組細胞中miR-1299表達水平顯著降低(P<0.05)，CyclinD1表達水平、細胞存活率顯著升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3表達水平、細胞凋亡率顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表6，圖4。

表6 低表達miR-1299可以逆轉FOXD2-AS1低表達對口腔鱗癌細胞CAL27增殖和凋亡的影響

圖4 蛋白表達圖

2.6 Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達 與si-NC組相比，si-FOXD2-AS1組β-catenin表達水平顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC+si-FOXD2-AS1組相比，anti-miR-1299+si-FOXD2-AS1組β-catenin表達水平顯著升高(P<0.05)。見表7，圖5。

表7 Western Blot檢測β-catenin蛋白表達

圖5 蛋白表達圖

3 討論

口腔鱗狀細胞癌是發(fā)生在口腔黏膜中最常見的惡性腫瘤，約占頭頸部惡性腫瘤的40%[8]，由于口腔鱗癌具有較強的侵襲和轉移復發(fā)特點，其治療效果不佳，給人類的生命健康帶來嚴重的威脅[9]。因此，尋找影響口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展的分子機制是靶向治療口腔鱗癌關鍵[10]。lncRNA和miRNA參與癌癥細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲等過程，并可參與癌癥的發(fā)生發(fā)展過程。研究表明lncRNA可通過調控miRNA參與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程[11,12]。

本實驗結果表明，口腔鱗癌細胞中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1表達水平顯著升高，當lncRNA FOXD2-AS1低表達時，CyclinD1表達水平、細胞存活率顯著降低，Cleaved-caspase-3表達水平、細胞凋亡率顯著升高。類似的研究已有報道。彭科瑜等[13]研究表明，lncRNA FOXD2-AS1通過靶向負調控miR-324-5p的表達影響結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力。王婷等[14]研究表明，lncRNAFOXD2-AS1通過靶向miR-506-5p調控宮頸癌細胞增殖與凋亡。上官文兵等[15]研究表明，lncRNA FOXD2-AS1具有調控膠質瘤細胞增殖及遷移的能力。

本實驗結果發(fā)現(xiàn)，口腔鱗癌細胞中miR-1299表達水平降低，當miR-1299高表達時，，CyclinD1表達水平、細胞存活率顯著降低，Cleaved-caspase-3表達水平、細胞凋亡率顯著升高。且本實驗還發(fā)現(xiàn)，低表達miR-1299可以逆轉lncRNA FOXD2-AS1低表達對口腔鱗癌細胞增殖和凋亡的影響。類似的研究已有報道；如Meng等[16]研究表明，miR-1299可促進食管鱗狀細胞癌細胞自噬。郭艷等[17]研究表明，miR-15b具有調控口腔鱗癌細胞增殖與凋亡能力；李擊等[18]研究顯示，miR-17-5p在口腔鱗狀細胞癌中有表達。

本實驗結果表明，低表達miR-1299逆轉了lncRNAFOXD2-AS1低表達對β-catenin表達的抑制作用。lncRNAFOXD2-AS1可能通過調控miR-1299影響Wnt/β-catenin信號通路的激活水平。類似的研究已有報道；如蘇文等[19]研究表明，β-catenin信號通路影響口腔鱗狀細胞癌的生物學行為；陳順金等[20]研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在口腔鱗癌干細胞的遷移、侵襲及EMT轉化中起調控作用。

綜上所述，干擾lncRNAFOXD2-AS1表達可能通過上調miR-1299抑制Wnt/β-catenin信號通路從而抑制口腔鱗癌細胞增殖，促進細胞凋亡。