蘇珮茹，羅香雅，曾春平，周 琳

(廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院/廣州市加速康復腹部外科重點實驗室/廣州醫(yī)科大學第五臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510700)

骨質(zhì)疏松癥是一種系統(tǒng)性代謝性骨病，其特征是骨量降低、骨組織微結(jié)構(gòu)損壞，進而導致骨脆性增加、骨折風險增高。隨著人口老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松癥發(fā)生率逐年升高，因骨質(zhì)疏松產(chǎn)生的并發(fā)癥如骨折，嚴重影響患者日常生活，并給患者及家屬帶來了嚴重的心理和經(jīng)濟負擔，因此尋求有效防治骨質(zhì)疏松的方法成為目前亟待解決的問題[1]。

貓眼草黃素是一種多甲氧基黃酮，存在于多種植物中，如澤漆(俗稱貓眼草)、黃花蒿、細花線紋香茶菜、巖筋菜等植物中[2]。黃酮類化合物是一種常見植物多酚，這類化合物與雌激素結(jié)構(gòu)類似，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗感染等作用[3]。部分黃酮類化合物能通過調(diào)控成骨細胞或破骨細胞功能，從而保護骨組織[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，貓眼草黃素能通過Wnt/β-catenin通路促進成骨細胞分化，改善雌激素缺乏誘導的骨丟失，從而對骨細胞起保護作用[5]。此外，貓眼草黃素是青蒿素代謝相關的CYP450酶亞型的抑制劑，能顯著提高青蒿素的抗瘧性[6]。研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素能顯著抑制破骨細胞的分化[7]。因此，推測貓眼草黃素除了能促進成骨細胞增殖，還能抑制破骨細胞分化。越來越多的研究表明，自噬參與破骨細胞的形成、分化及骨吸收作用等多個階段[8-10]。自噬與破骨細胞的關系是目前破骨細胞與骨質(zhì)疏松癥相關研究的新方向。因此，本文主要探討了貓眼草黃素對破骨細胞分化的影響及自噬在其中的作用，從而為骨質(zhì)疏松癥提供潛在的臨床治療方法。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 貓眼草黃素(C19H18O8，分子量：374.34，純度98%，CAS號：603-56-5)購自云南西力生物技術(shù)股份有限公司，采用二甲基亞砜配置成10 μmol/L溶液備用，按各目標濃度進行稀釋。小鼠單核巨噬細胞RAW264.7購自美國ATCC公司；α-MEN培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司，核轉(zhuǎn)錄因子-κB受體活化因子(RANK)配體(RANKL)購自美國R&D公司，抗LC3B抗體、抗ATG5抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG抗體購自成都正能生物科技公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組 將小鼠單核巨噬細胞RAW264.7用含10%小牛血清的α-MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中?？瞻捉M給予完全培養(yǎng)基，模型組給予含50.0 ng/mL RANKL的培養(yǎng)基，A～F組給予不同水平貓眼草黃素(0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L)+含50.0 ng/mL RANKL的培養(yǎng)基。

1.2.2抗酒石酸酸性磷酸酶染料(TRAP)染色 當細胞匯合度達到80%以上時，將小鼠單核巨噬細胞RAW264.7按每孔1.0×103的密度接種于96孔板中，用含10%小牛血清的α-MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，貼壁后按分組處理，每2天換1次培養(yǎng)液，總共培養(yǎng)5 d。4%多聚甲醛室溫固定細胞20 min，加入TRAP染色20 min，光鏡下觀察破骨細胞并計數(shù)，具有3個或更多個核的TRAP陽性多核細胞被認為是破骨細胞樣細胞。

1.2.3采用貓眼草黃素干預破骨細胞 (1)不同水平的干預。細胞接種貼壁后，加入含0、1.0、5.0、10.0 μmol/L貓眼草黃素的完全培養(yǎng)基及50.0 ng/mL RANKL刺激24 h，提取細胞裂解液，采用免疫印跡法(Western blot)檢測自噬相關蛋白表達情況：取細胞蛋白提取液，蛋白定量后加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min；以12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后孵一抗，4 ℃孵育過夜，用磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌；再加入相應的HPR標記二抗孵育1 h，PBST洗滌后顯影。(2)不同時間的干預。將RAW264.7細胞株按每孔5.0×104的密度接種于6孔板，加入含10.0 μmol/L貓眼草黃素的完全培養(yǎng)基及50.0 ng/mL RANKL，分別持續(xù)誘導1、3、5 d，收集細胞提取細胞裂解液，采用Western blot檢測自噬相關蛋白表達情況。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS23.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料多組間比較采用方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1貓眼草黃素對破骨細胞分化的影響 C～F組破骨細胞數(shù)量與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、2。

A.空白組；B.模型組;C.A組;D.B組;E.C組;F.D組;G.E組;H.F組。

2.2不同水平干預對自噬相關蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組及B、D、E組中自噬相關蛋白ATG5表達未見明顯變化(P>0.05)。與空白組比較，模型組自噬相關蛋白LC3Ⅱ表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加(P<0.05)。與模型組比較，B、D、E組自噬相關蛋白LC3Ⅱ表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低(P<0.05)。見圖3。

2.3不同時間干預對自噬相關蛋白表達的影響 與模型組比較，貓眼草黃素干預1、3、5 d時，自噬相關蛋白ATG5表達無明顯變化(P>0.05)。在干預3、5 d時，自噬相關蛋白LC3的表達較模型組明顯下降(P<0.05)。作用時效越長，貓眼草黃素抑制自噬的作用越明顯。見圖4。

與模型組比較，*P<0.05。

圖3 不同水平貓眼草黃素干預的Western blot檢測結(jié)果

圖4 不同時間干預的Western blot檢測結(jié)果

3 討 論

骨質(zhì)疏松是一種全身性代謝性骨病，在臨床上按病因主要分為原發(fā)性和繼發(fā)性。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥為臨床上常見類型，其可分為兩型：Ⅰ型為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，發(fā)生于絕經(jīng)后女性，主要由于雌激素缺乏導致骨量的流失；Ⅱ型為老年性骨質(zhì)疏松癥，多見于老年人，主要是年齡相關的生理性退行病變。繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥病因明確，是由某些藥物或疾病等引起的骨質(zhì)量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞和骨折風險增加的代謝性疾病，如糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松、甲狀腺功能亢進性骨質(zhì)疏松癥、糖尿病性骨質(zhì)疏松癥、風濕類疾病引起的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松等。

破骨細胞是高度分化的多核巨細胞，起源于造血干細胞，并受RANK和巨噬細胞集落刺激因子的調(diào)控，其主要功能是骨吸收[11]。在正常生理情況下，破骨與成骨的動態(tài)平衡使骨代謝保持穩(wěn)定狀態(tài)，當這種平衡被打破時，就可能導致骨穩(wěn)態(tài)失衡，最終發(fā)生骨質(zhì)疏松[12]。目前治療骨質(zhì)疏松的藥物很多，如雌激素、雙膦酸鹽、降鈣素、RANKL抑制劑等[13]，但部分具有費用昂貴、不良反應多等缺點。如雙磷酸鹽長期使用會引起胃腸道反應和腎功能損害；長時間使用雌激素替代治療會提高乳腺癌及子宮癌等腫瘤疾病的發(fā)生風險[14]。天然化合物具有療效顯著、作用靶點廣泛、不良反應少等特點，有可能成為骨質(zhì)疏松治療的最佳策略。

骨保護素(OPG)-RANKL-RANK系統(tǒng)是調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收的關鍵信號通路[15]。研究發(fā)現(xiàn)，在去卵巢優(yōu)勢的大鼠模型中，骨髓細胞中的RANKL表達明顯升高，促使OPG與RANKL比值下降，導致破骨細胞活性增強、骨吸收增強，提示絕經(jīng)后患者雌激素缺乏會激活OPG-RANKL-RANK軸而導致骨質(zhì)量下降，進而導致骨質(zhì)疏松[16]。目前多項研究發(fā)現(xiàn)，對于繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，部分藥物或疾病可以通過OPG-RANKL-RANK信號通路促進破骨細胞的形成及骨吸收，從而導致骨量丟失。如糖皮質(zhì)激素能促進RANKL分泌，促使RANKL與RANK結(jié)合并激活下游信號通路，從而提高破骨細胞活性，促進破骨細胞分化成熟。因此，長期使用糖皮質(zhì)激素易引起骨量丟失。炎性因子、生長因子等能激活RANK/RANKL通路，進而促進破骨細胞分化成熟及骨吸收功能，導致骨質(zhì)疏松[17]。因此，抑制OPG-RANKL-RANK信號通路，有利于治療骨質(zhì)疏松癥[18]。

貓眼草黃素是一種多甲氧基黃酮。研究表明，貓眼草黃素能抑制腸道病毒71型[19]和顯著提高青蒿素的抗瘧性[6]，其通過Wnt/β-catenin通路促進成骨細胞分化，改善雌激素缺乏誘導的骨丟失，從而對骨細胞起保護作用[5]。目前，關于貓眼草黃素對破骨細胞作用的研究較少見。本研究組前期研究證實，低劑量的貓眼草黃素可高效抑制RANKL誘導的信號通路，對破骨細胞的分化和活性產(chǎn)生影響，并最終調(diào)節(jié)骨代謝失衡。本研究結(jié)果顯示，通過不同水平貓眼草黃素干預后，TRAP染色陽性的破骨細胞數(shù)目逐漸減少，提示貓眼草黃素對破骨細胞的分化有抑制作用，且呈劑量依賴性，與前期研究結(jié)果相符。貓眼草黃素能抑制破骨細胞分化，其作用可能是通過抑制RANKL誘導的各種信號通路實現(xiàn)的。而多項研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性及繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥主要通過調(diào)節(jié)OPG-RANKL-RANK信號通路來促進破骨細胞分化、成熟及骨吸收。貓眼草黃素屬于黃酮類化合物，與雌激素結(jié)構(gòu)類似，具有抗炎、抗氧化等作用，其自身的生物活性與其抗骨質(zhì)疏松的特性密切相關，可能具有抑制類風濕關節(jié)炎、氧化應激、雌激素缺乏等病因引起的骨質(zhì)疏松癥的作用。上述研究提示，貓眼草黃素有可能成為靶向RANKL信號通路的新型藥物，其對各種類型骨質(zhì)疏松癥的作用及分子調(diào)控機制還有待進一步研究。

自噬是細胞在外界環(huán)境因素的影響下，利用溶酶體降解自身衰老、變性或受損的大分子物質(zhì)及細胞器的過程，在真核細胞內(nèi)調(diào)節(jié)細胞的代謝中起重要作用[20-21]。研究表明，自噬功能紊亂會導致腫瘤[22]、心臟病[23]、神經(jīng)退行性疾病及免疫失調(diào)等重大疾病[24]。目前越來越多文獻表明，自噬參與調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞、成骨細胞的增殖及破骨細胞的分化與活性的變化等，對于維持骨穩(wěn)態(tài)至關重要[25]。提示自噬有可能是骨代謝疾病的發(fā)病機制之一。研究發(fā)現(xiàn)，部分黃酮類化合物能通過調(diào)控自噬來調(diào)控細胞分化與功能，如山柰酚通過降解p62/SQSTM1抑制破骨細胞分化[26]；葛根素能抑制破骨細胞的自噬和增殖，自噬相關基因ATG5、ATG7和Beclin1的過度表達能逆轉(zhuǎn)葛根素抑制破骨細胞的自噬和增殖[27]。自噬在破骨細胞分化、成熟及骨吸收的過程中扮演重要角色，與自噬相關的蛋白(如ATG5、ATG7、ATG4B、ATG12和LC3等)[28]在破骨細胞形成與骨吸收過程中發(fā)揮重要的作用，其中LC3Ⅱ是LC3Ⅰ的脂化形式，其依賴泛素蛋白酶復合體定位于吞噬泡膜上，參與自噬溶酶體形成，常被用作自噬形成的標志物[29]。本研究結(jié)果顯示，貓眼草黃素在干預破骨細胞過程中對自噬相關蛋白ATG5表達的影響不明顯，但能抑制破骨細胞內(nèi)的自噬相關蛋白LC3表達，且破骨細胞分化時間越長，其抑制自噬的能力越明顯。提示貓眼草黃素可能通過自噬途徑抑制破骨細胞分化。

綜上所述，貓眼草黃素對破骨細胞的分化有抑制作用，且呈劑量依賴性，其可能通過自噬途徑發(fā)揮抑制作用。本研究為貓眼草黃素對骨質(zhì)疏松的治療提供了研究基礎及新方向，但具體的作用機制還有待進一步研究。