夏金星, 魯凡博, 黃 瑋, 徐元宏

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院, 1. 檢驗科, 2. 腫瘤內(nèi)科, 安徽 合肥, 230022)

侵襲性念珠菌感染是由念珠菌(又稱假絲酵母菌)所致的侵襲性感染，其表現(xiàn)為皮膚黏膜病變、真菌血癥以及多個部位的局灶性感染，且臨床癥狀因感染部位不同而異[1]。全球每年逾25萬人遭受侵襲性念珠菌感染，死亡率高達70%, 其已成為公共衛(wèi)生領域的重大威脅[2]。住院患者尤其重癥患者因病情危重、住院時間較長以及接受各種侵入性或有創(chuàng)性診療干預等，致使免疫系統(tǒng)功能受損，是念珠菌感染的高危人群[3-5]。研究[2]表明，真菌感染作為全球常見感染之一，其患者數(shù)量正逐年上升。侵襲性真菌的菌種差異使得感染的嚴重程度、治療藥物選擇和疾病預后等均有所不同[6]。因此，獲得本地區(qū)侵襲性真菌感染的流行病學特征及藥物敏感譜是臨床早期治療和改善患者預后的關鍵。

抗真菌感染藥物中，三唑類藥物尤其是氟康唑具有廣譜抗真菌作用、藥物靶向性強、水溶性好、生物利用度高及毒副作用低等優(yōu)點，常作為臨床一線治療藥物[7]。唑類藥物直接作用于念珠菌細胞膜麥角固醇合成中的關鍵酶，使合成通路受阻、細胞膜完整性受損及菌體內(nèi)毒性甲基化固醇類物質(zhì)累積而發(fā)揮抗真菌效應[8]。然而，隨著臨床上長期、廣泛地使用廣譜抗生素和頻繁預防性經(jīng)驗用藥，住院患者侵襲性真菌感染率逐年攀升，病原菌構成譜和耐藥譜不斷變遷，給臨床真菌感染診治帶來困難[5, 9]。合理、有效運用抗真菌藥物對住院患者尤其是重癥感染者預后尤為重要。為了解住院患者侵襲性真菌感染的病原菌種類及耐藥性特點，以提供及時、準確的臨床診療依據(jù)，本研究分析了內(nèi)、外科住院患者念珠菌感染無菌部位的臨床分布特征、相關風險因素以及5種抗真菌藥物對念珠菌的體外抑菌活性情況，并進一步探究了唑類耐藥菌可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

全程跟蹤研究安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院2018年1月—2019年6月臨床住院患者116例，直至患者病程轉(zhuǎn)歸。根據(jù)歐洲癌癥研究和治療組織/真菌病研究組修訂的侵襲性真菌病(IFD)指南和中華醫(yī)學會中國專家共識，將上述患者分為2組，其中41例患者住院期間全程未出現(xiàn)真菌感染納入陰性對照組，余者皆納入感染組(n=75)。收集感染組患者住院期間血液、無菌體液以及分泌物等無菌部位感染真菌共計80株，包括白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌以及克柔念珠菌等。該實驗包括了同一患者不同部位來源的不同菌株(或相同菌株但具不同藥敏特性)，并剔除了同一患者同一部位反復出現(xiàn)的相同菌株。以上菌株均經(jīng)科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基/沙保弱瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)和基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)全自動生物鑒定系統(tǒng)(法國梅里埃公司VITEK MS質(zhì)譜儀)鑒定。質(zhì)控標準菌株包括近平滑念珠菌ATCC 22019、克柔念珠菌ATCC 6258和熱帶念珠菌ATCC 750。

1.2 試劑與設備

ATB FUNGUS 3酵母菌藥敏試劑盒(微量稀釋法)、ATB Expression儀均購自法國生物梅里埃公司。柱式酵母總RNA抽提純化試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司。Thermo NanoDrop分光光度計儀購自美國Thermo Scientific公司。ABI 7300 PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。Tanon EPS-300水平式電泳儀購自上海天能科技有限公司。Bio-Rad Gel Doc XR凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。UNIQ柱式細菌基因抽提試劑盒、4S Red Plus核酸染料以及Taq PCR Master Mix購于上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 引物

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的相關基因序列，委托上海生工生物工程股份有限公司合成ERG3和ERG11基因引物。ERG3基因上、下游引物序列分別為: 5′-ATGGATATCGTACTAGAAATTTGT G-3′, 5′-TCATTGTTCAACATATTCTCTATC C-3′;ERG11基因上、下游引物序列分別為: 5′-GTTTTCTACTGGATCCCATG-3′, 5′-TACATCTGTGTCTACCACC-3′[10]。

1.4 方法

1.4.1 菌株鑒定和體外藥敏試驗: 選用科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基/沙保弱瓊脂培養(yǎng)基和法國梅里埃公司VITEK MS質(zhì)譜儀，遵循相關操作規(guī)程進行病原菌的培養(yǎng)與鑒定。采用法國梅里埃公司ATB FUNGUS 3真菌藥敏試劑盒進行藥敏試驗，抗真菌藥物包括兩性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑，按照說明書進行操作。質(zhì)控菌株按照說明書選擇近平滑念珠菌ATCC 22019、克柔念珠菌ATCC 6258和熱帶念珠菌ATCC 750。

1.4.2 念珠菌基因組DNA及目的基因提取和擴增: 嚴格遵照UNIQ柱式細菌基因抽提試劑盒說明書，提取熱帶念珠菌臨床分離株基因組DNA。聚合酶鏈反應(PCR)反應總體系為50 μL: 上游引物(10 μmol/L) 2 μL, 下游引物(10 μmol/L) 2 μL, Taq PCR Master Mix 25 μL, 蒸餾水 19 μL, DNA模板 2 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳、4S Red Plus 核酸染料染色后，置凝膠成像儀中照相分析。PCR反應條件如下: 預變性階段, 94 ℃ 5 min; 擴增階段，變性94 ℃ 30 s、退火50 ℃ 90 s、延伸72 ℃ 90 s, 循環(huán)擴增35次; 終延伸階段, 72 ℃ 8 min; 4 ℃保存。PCR產(chǎn)物純化后，委托通用生物有限公司進行測序，均做雙向測序。利用DNA序列分析軟件(DNASTAR, Inc. ,Madison, WI, USA), 將擴增產(chǎn)物基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫提供基因序列(GenBank accession no. : XM_002550 939.1)進行對比分析，確定基因突變位點。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以[n(%)]表示，數(shù)據(jù)組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗;P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 菌種鑒定及其標本類型分布

該研究全程跟蹤分析了116例住院患者，其中75例患者發(fā)生侵襲性念珠菌感染，余者無真菌定植及念珠菌感染。所得樣本通過血培養(yǎng)/真菌顯色培養(yǎng)基/沙保弱培養(yǎng)基培養(yǎng)，分離后經(jīng)MALDI-TOF MS全自動生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)分析鑒定，共獲80株念珠菌(圖1)。白色念珠菌是無菌部位侵襲性真菌感染最為常見的致病菌，感染率達45.00%(36/80)。而光滑念珠菌和熱帶念珠菌是其最常見的非白色念珠菌，兩者感染率分別是32.50%(26/80)、13.75%(11/80)。其他念珠菌感染率均小于10.00%(圖1C)。尿液為最常見的標本類型，構成比達50.00%(40/80); 其次是分泌物和血液，構成比分別為27.50%(22/80)、5.00%(4/80)。見表1。

A: 念珠菌培養(yǎng)物革蘭染色示例, Ⅰ～Ⅳ分別是白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌,比例尺為10 μm; B: 念珠菌質(zhì)譜鑒定示例, i～iv分別為白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌; C: 侵襲性念珠菌菌株分布(n=80)。圖1 侵襲性念珠菌菌種鑒定及菌株分布

表1 臨床菌株標本類型分布特征[n(%)]

2.2 抗真菌藥物對侵襲性念珠菌體外抑菌效果

大多數(shù)念珠菌在體外對兩性霉素B和5-氟胞嘧啶高度敏感，平均敏感率超過98.00%, 其中光滑念珠菌對兩性霉素B的敏感性為96.20%。然而，侵襲性念珠菌對唑類藥物表現(xiàn)出不同的體外敏感程度。對于白色念珠菌，三唑類藥物氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的敏感性分別為94.40%、94.40%和100.00%。對于光滑念珠菌，三唑類藥物氟康唑和伏立康唑的體外抑菌活性均超95.00%,而伊曲康唑?qū)ζ潴w外抑菌活性僅為76.90%。對于近平滑念珠菌，氟康唑與伏立康唑的體外抑菌活性均是83.30%, 優(yōu)于伊曲康唑(66.70%)。對于克柔念珠菌，伏立康唑的體外抑菌活性則達100.00%。對于熱帶念珠菌，兩性霉素B和5-氟胞嘧啶的體外抑菌活性都為100.00%; 然而，三唑類藥物對熱帶念珠菌敏感性普遍偏低，其中伊曲康唑體外抑菌活性最低，僅為54.50%, 其最低抑菌濃度(MIC)范圍為0.12～4.00 μg/mL, MIC50和MIC90分別為0.13 μg/mL、2.00 μg/mL; 氟康唑和伏立康唑?qū)釒钪榫w外抑菌活性分別為63.60%和81.80%。見表2。

表2 抗菌藥物對念珠菌的體外抑菌效果(n=80)

對所有唑類耐藥熱帶念珠菌臨床分離株(共4株)的ERG3和ERG11基因進行PCR和測序分析。經(jīng)凝膠電泳分析后，其條帶大小與DNA marker比較，位置相符且無其他非特異性擴增。將耐藥株的唑類耐藥相關基因ERG3與ERG11測序序列分別進行BLAST比對，以起始密碼子ATG中A作為序列起始計數(shù)1, 確定突變位點。

ERG11基因測序結果顯示, 4株熱帶念珠菌耐藥株ERG11基因同時存在4處點突變(T225C、G264A、A395T和C461T), 其中2處為同義突變(T225C和G264A), 另2處為錯義突變(對應氨基酸殘基分別更替為Y132F和S154F)(圖2)。ERG3基因測序結果顯示, 4株熱帶念珠菌耐藥株中僅2株ERG3基因均存在1處點突變(G366A), 且為同義突變。

通過仿PBD-blast(http: //www.pdb.org)PDB ID 5JLC結構圖,計算預測4株唑類耐藥熱帶念珠菌ERG11蛋白分子唑類藥物進出通道結構內(nèi)部和開口位置[11]; 紅色: 突變位點Y132; 黃色: 突變位點S154; 標準參考序列源自熱帶念珠菌GenBank(Accession no.:XM_002550 939.1)序列信息。圖2 熱帶念珠菌ERG11酶分子三維結構模型圖與突變位點

2.3 侵襲性念珠菌感染的臨床分布特征

本研究中，侵襲性念珠菌感染患者性別構成比基本相同，即男性患者占43.75%、女性患者占56.25%。但不同性別間常見侵襲性念珠菌種類有所不同，男性住院患者最常見侵襲性念珠菌為白色念珠菌(占所獲相應菌株數(shù)比率為54.29%, 19/35), 其次為光滑念珠菌(20.00%, 7/35)與熱帶念珠菌(14.29%, 5/35); 女性住院患者主要侵襲性念珠菌則為光滑念珠菌(42.22%, 19/45), 而白色念珠菌(37.78%, 17/45)和熱帶念珠菌(13.33%, 6/45)次之。其中1株克柔念珠菌來自女性患者。侵襲性念珠菌感染患者年齡與感染率呈現(xiàn)正相關趨勢。感染患者平均年齡為(58.89±19.23)歲，中位數(shù)年齡為63歲。易受侵襲性念珠菌感染的年齡段人群主要為50歲以上住院患者，構成比達70.00%; 此年齡段中，白色念珠菌為主要致病菌，占48.21%(27/56), 其次包括光滑念珠菌(26.79%, 15/56)、熱帶念珠菌(14.29%, 8/56)與近平滑念珠菌(10.71%, 6/56); 尤其在年齡大于65歲患者中，與對照組(10株)相比，感染組患者(34株)更易感染侵襲性念珠菌，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 且白色念珠菌和光滑念珠菌感染比率分別為47.06%(16/34)、32.35%(11/34)。而在0～14歲年齡段，侵襲性念珠菌感染構成比僅為3.75%, 皆為白色念珠菌感染。15～49歲年齡段分離出克柔念珠菌1株。

侵襲性念珠菌感染患者住院時間與感染率亦呈正相關趨勢。半數(shù)以上侵襲性念珠菌感染出現(xiàn)于住院14 d以上的患者群(63.75%, 51/80), 與對照組(31.71%, 13/41)比較該住院時間可歸為顯著性易感風險因素(P<0.001); 而住院時間<7 d的患者僅占7.50%(6/80)。住院時間>14 d和<7 d患者中，白色念珠菌為最常見侵襲性真菌，分別占47.06%(24/51)和66.67%(4/6)。而住院時間7～14 d的患者群中，光滑念珠菌是最為常見的侵襲性真菌，占43.48%(10/23), 且分離出1株克柔念珠菌。侵襲性念珠菌感染科室分布情況同對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。內(nèi)科住院患者感染念珠菌風險較低且以光滑念珠菌(48.28%, 14/29)為主; 外科患者住院期間感染念珠菌的風險相對較高，尤以白色念珠菌(54.90%, 28/51)感染為甚; 對照組來自內(nèi)、外科系統(tǒng)菌株數(shù)分別為30株與11株。在疾病臨床轉(zhuǎn)歸方面與對照組(未跟蹤到任何病情惡化事件)比較，感染組患者病情惡化率較高(16.25%, 13/80)(P=0.005), 且出現(xiàn)死亡病例，而對照組沒有患者死亡。

本研究進一步分析了與侵襲性念珠菌感染相關特征性臨床風險因素。由侵入性操作引起的風險因子包括: 尿道插管，感染組36株(45.00%)與對照組7株(17.07%)(P=0.002); 氣管插管，感染組23株(28.75%)與對照組4株(9.76%)(P=0.018); 呼吸機輔助，感染組24株(30.00%)與對照組4株(9.76%)(P=0.012); 氣管切開術，感染組12株(15.00%)與對照組0株(P=0.022); 住院期間手術史，感染組41株(51.25%)與對照組4株(9.76%)(P<0.001)。其中，呼吸機輔助和氣管切開術的患者主要受白色念珠菌與光滑念珠菌的侵襲性感染，且感染概率相同; 而其他風險因素主要引起白色念珠菌感染，其次為光滑念珠菌感染。此外，癌癥患者(22.50%, 18/80)感染念珠菌的風險高于對照組(2.44%, 1/41), 差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.004)。感染組與對照組間諸如動/靜脈插管、內(nèi)鏡、血液/腹膜透析、免疫抑制劑治療、糖尿病、肝硬化、燒傷、肺部感染、顱內(nèi)出血以及合并細菌感染等危險因素比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討 論

住院患者是侵襲性真菌感染的重要人群，尤其是創(chuàng)傷、手術及燒傷等患者，提示皮膚、黏膜等屏障受損使念珠菌感染風險增加。此外，某些重癥住院患者因病情處置所需，靜脈或泌尿道導管留置、氣管插管或切開、呼吸機以及廣譜抗生素等的廣泛使用，常會破壞皮膚、生殖道等黏膜屏障、呼吸道解剖屏障和機體菌群屏障，進一步增加了包括念珠菌在內(nèi)的侵襲性真菌感染風險[3]。同時，侵襲性念珠菌感染與不合理使用抗真菌藥物的經(jīng)驗治療息息相關[1, 12]。因此，早期合理、規(guī)范使用抗真菌藥物治療，有望改善侵襲性念珠菌感染患者的預后[13]。

越來越多的唑類抗真菌藥物應用于侵襲性真菌病的臨床預防性或經(jīng)驗性治療，導致侵襲性念珠菌流行病學趨勢不斷改變，非白色念珠菌感染率逐年遞增，新的真菌病原體亦層出不窮，最終導致念珠菌對唑類藥物的敏感性逐漸減弱[12, 14]。本研究顯示，住院患者中，白色念珠菌仍然是導致侵襲性念珠菌感染的主要致病菌，光滑念珠菌和熱帶念珠菌則是侵襲性念珠菌感染的主要非白色念珠菌。有學者[15]報道，近平滑念珠菌是導致住院患者侵襲性念珠菌感染的主要非白色念珠菌，該結論的出入或與醫(yī)院間標本來源、標本種類、患者年齡、住院時長及基礎疾病的不同相關。本研究的標本來源主要是住院患者的尿液、分泌物和血液，患者平均住院時間較長，并存在呼吸道及泌尿道插管等干預，導致侵襲性念珠菌感染的發(fā)生率增高。

在侵襲性念珠菌感染組中，患者多數(shù)為年長者(中位數(shù)年齡達63歲)，超過一半患者的年齡超過50歲，且住院時間相對較長，住院時間超過14 d。前者或隨年齡增長，存在的基礎疾病風險增加; 后者或因住院時間延長，加之患者病情可能本就更為嚴重，使用抗生素及有創(chuàng)性操作的時間和頻次增多，因而更易遭受侵襲性念珠菌的感染[16-17]。本研究中，尿道插管、氣管插管、使用呼吸機、氣管切開術及住院期間手術史、癌癥是住院患者發(fā)生侵襲性念珠菌病的高危指征。侵入性操作如氣管切開術，通常是導致重癥住院患者念珠菌定植/感染概率增加的關鍵因素。既往研究[18]表明，多種因素如癌癥患者由于放療或化療引起的不良反應，或由于癌細胞播散累及多臟器致宿主免疫功能下降、大量使用激素、不合理運用廣譜抗生素以及其他外因等影響，易導致院感相關念珠菌感染的發(fā)生。

念珠菌耐藥機制涉及諸多因素，主要與外排泵基因過度表達、基因突變、細胞壁構成改變及生物膜形成等相關[19]。隨著真菌耐藥率的不斷升高，需要了解念珠菌的耐藥情況，尤其是目前臨床常用的三唑類藥物的耐藥，探討其耐藥機制可為防治侵襲性念珠菌感染提供理論依據(jù)。本研究真菌藥敏結果顯示，三唑類藥物、兩性霉素B和5-氟胞嘧啶對大部分侵襲性念珠菌感染均具有較好的藥物敏感性。然而，氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑等三唑類抗真菌藥物出現(xiàn)了主要針對熱帶念珠菌耐藥現(xiàn)象。熱帶念珠菌是一種臨床常見的條件致病真菌，其耐藥機制較為復雜，除與菌株生物膜形成、細胞代謝反應及基因突變等有關外，還與2種關鍵基因(ERG3和ERG11)密切相關[20]。ERG3基因編碼念珠菌細胞膜麥角甾醇合成途徑后期階段的一種關鍵酶。ERG11基因編碼羊毛甾醇14a-去甲基化酶，為念珠菌細胞膜麥角甾醇合成途徑關鍵酶，是臨床唑類藥物作用的靶酶。常用的唑類藥物如氟康唑通過與其結合使靶酶失活而達到抗菌作用[19]。研究[19, 21]發(fā)現(xiàn),ERG3和ERG11突變可引起其編碼的酶活性和三維結構發(fā)生改變，降低其對唑類藥物的親和力，使藥物難以發(fā)揮有效作用。本研究共收集11株熱帶念珠菌，其中4株對至少1種唑類藥物耐藥，耐藥率達36.36%。菌株ERG11測序結果顯示, 4株耐藥菌株同時出現(xiàn)A395T和C461T基因點突變(錯義突變)，三維蛋白分子建模分析表明，其(Y132F和S154F)分別位于唑類藥物進出通道的通道結構內(nèi)部和通道開口處，推測可能是2處突變發(fā)揮協(xié)同效應，使藥物作用靶酶(ERG11蛋白)產(chǎn)生明顯改變，進而降低藥物與靶酶的親和力[11, 21]。ERG3測序顯示，僅2株耐藥菌株發(fā)生1處同義突變，該突變在其他研究中也有報道，但具體作用有待進一步探究。本研究受相應真菌病診斷標準、真菌感染率及區(qū)域因素等限制，全程跟蹤收集研究樣本比例相對有限或為本研究不足之處; 但對相關疾病區(qū)域性臨床診療具有一定指導或參考意義。

綜上所述，本研究對近年安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院住院患者無菌部位侵襲性念珠菌感染的菌株分布、臨床特征和真菌藥物敏感性情況進行了系統(tǒng)性跟蹤分析。研究結果顯示，白色念珠菌為住院患者侵襲性念珠菌感染的主要致病菌，患者年齡、住院時間、住院期間有創(chuàng)性干預(尿道插管、氣管插管、呼吸機輔助、氣管切開術和手術史)以及癌癥等可考慮作為真菌感染的主要危險因素。兩性霉素B、5-氟胞嘧啶及唑類藥物對非熱帶念珠菌均具有良好的體外抑菌活性，而熱帶念珠菌ERG11基因2處錯義突變(A395T和C461T)可能與唑類藥物耐藥密切相關。但熱帶念珠菌對唑類藥物耐藥存在多種耐藥機制且過程復雜，需不斷深入與持續(xù)性研究。本研究為住院侵襲性念珠菌感染患者合理、規(guī)范使用抗真菌藥物提供參考，以期降低臨床侵襲性念珠菌感染死亡率，提高診療效果。