侯寶洲, 李慧平, 魏思忱, 穆宗瑋, 李麗娟, 田樹英

(河北省滄州市中心醫(yī)院, 1. 消化內(nèi)二科, 2. 醫(yī)務部, 河北 滄州, 061000)

肝癌是中國主要的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第5位，病死率居第7位[1]。肝癌的具體發(fā)病機制仍不清楚，考慮與肝臟局部微環(huán)境中炎癥反應、病毒感染、氧化應激、損傷修復以及遺傳基因功能改變等有關[2]。血管新生是所有惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要機制[3]。血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)是目前最強效的促血管新生的細胞因子，與多種惡性腫瘤的發(fā)生及患者生存預后密切相關[4]。可溶性胸苷激酶-1(TK-1)是調(diào)控DNA結構和功能表達的重要活性酶，與DNA能量代謝和損傷修復有關[5]。TK-1被證實與多種惡性腫瘤如上皮性卵巢癌、結直腸癌的發(fā)生和臨床預后密切相關[6]。肝癌的發(fā)生與細胞免疫逃逸機制有關[7], T淋巴細胞亞群是機體細胞免疫的主要成分，在誘導殺傷癌細胞、促進癌細胞凋亡方面發(fā)揮重要作用[8]。本研究分析肝癌患者血清中VEGF、TK-1、T淋巴細胞亞群與腫瘤臨床病理特征及患者生存預后的相關性，現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2018年9月—2020年9月105例在本院確診肝細胞癌患者的臨床資料，男60例，女45例，平均年齡(63.2±8.4)歲。納入標準: ① 年齡>18歲者; ② 符合原發(fā)性肝癌診斷標準者[9]; ③ 臨床資料完整者。排除標準: ① 入院前已經(jīng)接受肝癌手術、放化療者; ② 合并肝轉(zhuǎn)移瘤、肝功能衰竭者; ③ 合并嚴重心、肺、腎功能障礙，自身免疫性疾病以及營養(yǎng)代謝性疾病者; ④ 妊娠、哺乳期女性。

1.2 研究方法

患者入院24 h內(nèi)采集空腹外周靜脈血10 mL, 采用ELISA法檢測VEGF、TK-1水平，試劑購自美國Sigma公司; 流式細胞術檢測T淋巴細胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+百分比和CD4+/CD8+), 淋巴細胞亞群分析試劑和單克隆酶聯(lián)免疫試劑盒購自美國BD公司，按試劑說明書的要求操作。

統(tǒng)計腫瘤臨床病理特征，主要包括性別、年齡、TNM分期、乙型肝炎病毒(HBV)感染、分化級別、腫瘤直徑、淋巴結轉(zhuǎn)移和血管浸潤。出院后隨訪時間5～30個月，中位時間20.5個月，存活73例，死亡32例。分析血清VEGF、TK-1、T淋巴細胞亞群與腫瘤臨床病理特征及患者生存預后的關系。HBV感染采用血清病原學和HBV DNA定量檢測進行確診。出院后1、3、6、12個月以及此后每隔6個月門診隨訪，復查肝功能和肝臟超聲，記錄腫瘤復發(fā)情況和患者生存狀況。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗; 計數(shù)資料以[n(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗; 生存預后的危險因素分析采用多因素Cox回歸模型，采用逐步后退法計算受試者工作特征(ROC)曲線的曲線下面積(AUC)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 VEGF、TK-1與腫瘤臨床病理特征及生存預后的關系

入院VEGF、TK-1與HBV感染、TNM分期、分化級別、淋巴結轉(zhuǎn)移、血管浸潤和生存預后相關，表現(xiàn)為HBV感染陽性、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、淋巴結轉(zhuǎn)移陽性、血管浸潤陽性以及死亡患者的入院血清VEGF、TK-1水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

mg/L

2.2 T淋巴細胞亞群與腫瘤臨床病理特征、生存預后的關系

入院CD4+/CD8+與HBV感染、TNM分期、分化級別、淋巴結轉(zhuǎn)移、血管浸潤和生存預后相關，表現(xiàn)為HBV感染陽性、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、淋巴結轉(zhuǎn)移陽性、血管浸潤陽性以及死亡患者的入院血清CD4+/CD8+降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); CD3+、CD4+、CD8+百分比與腫瘤臨床病理特征、生存預后無相關性(P>0.05)。見表2。

表2 T淋巴細胞亞群與腫瘤臨床病理特征、生存預后的關系

2.3 治療前后VEGF、TK-1和T淋巴細胞亞群

的比較

與治療前比較, 105例肝癌患者治療后VEGF、TK-1水平下降, CD4+百分比、CD4+/CD8+升高，CD8+百分比下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 105例肝癌患者治療前后VEGF、TK-1及T淋巴細胞亞群比較

2.4 生存預后危險因素的Cox回歸分析

多因素Cox回歸分析顯示, TNM分期(Ⅲ～Ⅳ期)、淋巴結轉(zhuǎn)移、血管浸潤、VEGF、TK-1以及CD4+/CD8+是生存預后的影響因素(P<0.05)。見表4。

表4 生存預后危險因素的Cox回歸分析

2.5 生存預后的ROC曲線分析

ROC曲線分析顯示，入院VEGF、TK-1、CD4+/CD8+預測生存預后的AUC分別為0.824、0.869、0.756，聯(lián)合預測的AUC為0.912，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 生存預后的ROC曲線分析

3 討 論

本研究結果顯示，入院血清VEGF、TK-1、CD4+/CD8+與HBV感染、TNM分期、分化級別、淋巴結轉(zhuǎn)移、血管浸潤、生存預后顯著相關(P<0.05); HBV感染陽性、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、淋巴結轉(zhuǎn)移陽性、血管浸潤陽性以及死亡患者的入院血清VEGF、TK-1水平顯著升高, CD4+/CD8+顯著降低，提示VEGF、TK-1、CD4+/CD8+參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展以及臨床預后[9], 與既往研究[10-13]結論相似，但VEGF信號通路與腫瘤免疫微環(huán)境的復雜關系仍不清楚。研究[14-15]表明, VEGF信號通路與免疫細胞浸潤和66種免疫標記物的表達呈正相關，與活化的CD8+T細胞以及臨床預后呈正相關。在肝癌患者中, VEGF信號通路和腫瘤免疫微環(huán)境共同激活是抗VEGF藥物以及聯(lián)合免疫檢查點抑制劑(ICB)治療的重要機制[16]。

謝榮章等[17]研究指出，聯(lián)合血清甲胎蛋白(AFP)、TK-1和Dickkopf-1(DKK-1)蛋白檢測可提高原發(fā)性肝癌的早期診斷準確率。TK-1活性與DNA合成過程有關，是腫瘤增殖和細胞周期調(diào)控的重要功能酶, TK-1上調(diào)往往與細胞核增殖指數(shù)呈正相關，是多種惡性腫瘤的重要診斷標志物[18]。目前, ICB和嵌合抗原受體T細胞在腫瘤臨床治療中得到越來越多的應用，宿主免疫系統(tǒng)在腫瘤免疫治療中對腫瘤細胞的識別和靶向起著重要的作用[19-20]。利用人類免疫細胞進行免疫治療取得了許多進展，但是一種單獨的免疫療法對癌癥的治療效果不理想，有效的免疫治療組合如ICB聯(lián)合免疫細胞治療有重要的應用前景[21]。HUANG C Y等[22]指出, PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑在各種類型的實體瘤中顯示出良好的臨床效果，其進行的生存分析表明腫瘤和間質(zhì)PD-L1狀態(tài)對患者的總生存率或無復發(fā)生存率無顯著影響，而高CD8+T細胞密度的患者有較好的總體生存率和無復發(fā)生存率，但其良好的預后價值因PD-L1高表達而被消除。特異性CD8+細胞毒性T細胞(CTL)通過人類白細胞抗原(HLA)的I類分子表達顯著上調(diào)腫瘤細胞系PD-L1的表達，腫瘤PD-L1過度表達以負反饋調(diào)節(jié)機制降低了CD8+CTL干擾素-γ的分泌。由此推測, PD-L1表達與肝癌CD8+T細胞免疫存在緊密相互作用[23-24]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，肝癌患者治療后VEGF、TK-1水平下降, CD4+百分比和CD4+/CD8+升高, CD8+百分比下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。多因素Cox回歸分析顯示, TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、血管浸潤、VEGF、TK-1、CD4+/CD8+是生存預后的影響因素(P<0.05); 血清VEGF每升高1個標準差，患者死亡風險增加0.865倍(HR=1.865); TK-1每升高1個標準差，患者死亡風險增加0.624倍(HR=1.624); CD4+/CD8+降低1個標準差，患者死亡風險增加0.329倍(HR=1.329)。ROC曲線分析顯示，入院VEGF、TK-1、CD4+/CD8+聯(lián)合檢測預測肝癌患者死亡的AUC為0.912，高于任意單一指標，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。本研究仍存在樣本量不足、隨訪時間過短等局限性，而回顧性研究可能對實驗結果造成偏倚，未來將擴大樣本量，延長隨訪時間，采取多中心、前瞻性隨機對照研究予以證實。

綜上所述，肝癌患者血清VEGF和TK-1表達升高, CD4+/CD8+下降，與多個腫瘤臨床病理特征和患者生存預后密切相關，聯(lián)合VEGF、TK-1和CD4+/CD8+預測生存預后有較高的價值。