孫琳茜 王子葉 王麗芹 李 清 常曉天 王吉波 （青島大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，青島 266000）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜關(guān)節(jié)受累為主要臨床表現(xiàn)的慢性炎癥性系統(tǒng)疾病，發(fā)病及發(fā)展過(guò)程中有多種細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)參與，其中IL-6、TNF-α、IL-1β 等是最重要的致炎因子［1］。RA 有較高致殘率并嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，研究者一直在探索其治療方法。目前治療RA 的藥物及方法雖然較多，但仍不能解決全部問(wèn)題［2-3］。近十年試驗(yàn)性基因治療業(yè)已悄然興起，靶向致炎癥細(xì)胞因子的RNA 干擾（RNA interference，RNAi）成為一種新興療法。因?yàn)槁《揪哂谢蜣D(zhuǎn)導(dǎo)效率高、能夠通過(guò)基因整合而實(shí)現(xiàn)基因穩(wěn)定表達(dá)等特點(diǎn)，常用作RNAi 的載體。本研究團(tuán)隊(duì)前期已完成慢病毒介導(dǎo)靶向TNF-α 基因RNA 干擾的體外及體內(nèi)研究，取得了令人振奮的效果［4-5］。本研究再次以慢病毒為載體，以小鼠IL-6 為靶基因，構(gòu)建RNAi 慢病毒載體顆粒，采用小鼠巨噬細(xì)胞株J774A.1細(xì)胞與膠原誘導(dǎo)性小鼠關(guān)節(jié)炎模型（collageninduced arthritis，CIA）分別進(jìn)行體外、體內(nèi)試驗(yàn)，以觀察其作用效果。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠單核巨噬細(xì)胞J774A.1（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心）；DBA/1小鼠（斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，上海）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（HyClone，美國(guó)）；胎牛血清（fatal bovine serum，F(xiàn)BS，Gibco，美國(guó)）；IL-6 siRNA及siRNA scramble陰性對(duì)照（吉瑪基因，上海）；lipofectamine3000（Invitrogen，美國(guó)）；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒（TaKaRa，大連）；引物（生工生物，上海）；GV248 質(zhì)粒（吉?jiǎng)P基因，上海）；牛Ⅱ型膠原、弗氏完全佐劑（Chondrex，美國(guó)）；MTX（輝瑞制藥，美國(guó)）；小鼠來(lái)源IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 試劑盒（R&D Systems，美國(guó)）；4%多聚甲醛、10%EDTA 溶液（索萊寶，北京）。

1.2 方法

1.2.1 靶向IL-6的RNAi慢病毒顆粒構(gòu)建

1.2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞J774A. 1，細(xì)胞密度達(dá)80%~90%時(shí)傳代，傳代比例1∶3。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.1.2 設(shè)計(jì)、合成、篩選高效siRNA 序列 從Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取小鼠IL-6 基因mRNA 序列（NM_031168），根據(jù)小干擾 RNA（small interference RNA，siRNA）設(shè)計(jì)原則，合成3對(duì)特異性針對(duì)IL-6基因的 siRNA 序列（siRNA-1，siRNA-2 和 siRNA-3）及siRNA scramble陰性對(duì)照序列（negative control-RNAi，NC-RNAi，表1）。實(shí)驗(yàn)分為siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3 組，并設(shè)NC-RNAi 組、培養(yǎng)基空白對(duì)照組。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以8×104個(gè)/孔接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24 h 后細(xì)胞融合達(dá)50% 時(shí)，利用lipofectamine3000轉(zhuǎn)染J774A.1細(xì)胞。48 h后收集細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)siRNA干擾效率。

表1 IL-6 RNAi序列Tab.1 IL-6 RNAi sequences

1.2.1.3 RT-qRCR 檢 測(cè) Trizol 法 提 取 J774A. 1 細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度，吸光度值（A260/280）均為 1.8~2.0。使用 PrimeScriptTMRT 試劑盒將1 ug 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。使用 Premix Ex Tag 試劑盒，采用LightCycler96 PCR儀擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃30 s（1 個(gè)循環(huán)），95 ℃ 5 s 和 60 °C 30 s（40 個(gè)循環(huán)）。Primer Express 3.0 軟件設(shè)計(jì)小鼠 IL-6 和 GAPDH 基因引物，引物序列見表2。LightCycler96軟件自動(dòng)記錄Ct 值，采用2-ΔΔCt方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.1.4 shRNA構(gòu)建 篩選出siRNA-1為高效IL-6 siRNA 序列：5'-AGAGTCCTTCAGAGAGATA-3'；陰性對(duì)照組（NC-RNAi）核心序列：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。按慢病毒載體構(gòu)建要求設(shè)計(jì)、合成寡核苷酸片段，正向單鏈內(nèi)21 nt的寡核苷酸以正反向組合，中間添加loop結(jié)構(gòu)，使寡核苷酸形成短發(fā)卡結(jié)構(gòu)（short hairpin RNA，shRNA），寡核苷酸兩端帶有酶切位點(diǎn)。雙鏈結(jié)構(gòu)序列為：5'-CCGGCCAGAGTCCTTCAGAGAGATACTCGAGTATCTCTCTGAAGGACTCTGGTTTTG-3'，用于構(gòu)建表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的靶向IL-6的 RNAi 慢病毒顆粒（LV-IL-6-RNAi）及陰性對(duì)照RNAi慢病毒顆粒（LV-NC-RNAi）。

1.2.1.5 重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建 寡核苷酸片段退火形成雙鏈DNA 目的片段，GV248 質(zhì)粒作為工具載體，酶切后與目的片段通過(guò)T4連接酶制備載體質(zhì)粒。載體質(zhì)粒加入感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化，經(jīng)PCR 鑒定選取陽(yáng)性菌落，2%瓊脂糖凝膠電泳。選取轉(zhuǎn)化成功的載體質(zhì)粒PCR 測(cè)序檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證。測(cè)序正確的單菌落擴(kuò)增后，去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒。

1.2.1.6 慢病毒包裝、濃縮純化、感染滴度確定將制備的載體質(zhì)粒分別與輔助質(zhì)粒pHelper1.0 和pHelper 2.0共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)48~72 h后收獲含病毒的上清。4 000 g 離心10 min 除去細(xì)胞碎片后以0.45 μm 濾器過(guò)濾，4 ℃、25 000 r/min 離心2 h，棄上清后加病毒保存液重懸，4 ℃、10 000 r/min再次離心5 min取上清病毒液分裝。

1.2.2 LV-IL-6-RNAi 轉(zhuǎn)染J774A. 1 細(xì)胞的感染滴度及干擾效率測(cè)定 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期J774A.1細(xì)胞用DMEM 高糖完全培養(yǎng)基制備 5×104個(gè)/ml 懸液，取100 μl/孔加入96孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h細(xì)胞融合度約30%時(shí)進(jìn)行LV-IL-6-RNAi、LV-NC-RNAi病毒感染，用病毒稀釋液將病毒稀釋為1×108TU/ml、1×107TU/ml、1×106TU/ml 3 個(gè)濃度梯度，即感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為1、10、100。每孔加入10μl 病毒液與完全培養(yǎng)基配成100μl 培養(yǎng)體系，培養(yǎng)48~72 h 后熒光顯微鏡觀察表達(dá)GFP 細(xì)胞數(shù)量確定感染滴度。

J774A.1 細(xì)胞以 8×104個(gè)/孔接種于 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng) 24 h，設(shè) LV-IL-6-RNAi 組、LV-NC-RNAi組、培養(yǎng)基空白對(duì)照組，以最佳感染滴度病毒顆粒感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期J774A.1 細(xì)胞，培養(yǎng)96 h，感染效率約80%時(shí)，Trizol獲取細(xì)胞RNA，RT-qPCR檢測(cè)IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，引物序列見表2（方法同1.2.1.3）。

表2 RT-qPCR引物序列Tab.2 RT-qPCR primer sequences

1.2.3 LV-IL-6-RNAi治療CIA療效觀察及測(cè)定

1.2.3.1 小鼠CIA 模型構(gòu)建及CIA 關(guān)節(jié)炎評(píng)分牛Ⅱ型膠原于0.1 mol/L 冰醋酸充分溶解，配成濃度為2 mg/ml 溶液，4 ℃冰箱保存過(guò)夜后與等體積弗氏完全佐劑充分混合乳化。第1天每只小鼠尾根部分3點(diǎn)皮內(nèi)注射乳劑0.1 ml，第21天以同樣方法、相同劑量第2 次加強(qiáng)免疫注射［6］。免疫結(jié)束后每日觀察小鼠關(guān)節(jié)炎情況，隔日進(jìn)行CIA 關(guān)節(jié)炎評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，正常爪；1分，1趾紅腫；2分，＞1個(gè)趾紅腫，但未累及全爪，或全爪中度腫脹；3 分，全爪紅腫；4 分，關(guān)節(jié)重度紅腫或強(qiáng)直。四爪總分為該小鼠CIA 評(píng)分［7］。

1.2.3.2 LV-IL-6-RNAi 治療 CIA 的療效 第 2 次加強(qiáng)免疫注射前24 h，CIA 模型小鼠隨機(jī)分為CIA-LV-IL-6-RNAi組、CIA-LV-NC-RNAi組、CIA-MTX組、CIA-PBS空白對(duì)照每組7只，并設(shè)健康對(duì)照組。分別向小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射LV-IL-6-RNAi（1×106TU/ml）、LV-NC-RNAi（1×106TU/ml），腹腔注射MTX（1 mg/kg）、等體積PBS，健康小鼠腹腔注射等體積PBS，每周3次。

首次免疫注射后第42天（注射LV-IL-6-RNAi等處理后第21 天）麻醉小鼠行心內(nèi)穿刺取血，ELISA法檢測(cè)小鼠血清IL-6、TNF-α 及IL-1β 水平。取關(guān)節(jié)組織置于4%多聚甲醛4 ℃固定過(guò)夜，隨后在pH7.4的10%EDTA 溶液中4 ℃保存2周，脫鈣，石蠟包埋，切片（4μm），室溫染色（蘇木精5 min、伊紅30 s），光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所得計(jì)量資料用表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way analysis of variance，one-way ANOVA），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，每組樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1 IL-6 RNAi慢病毒顆粒構(gòu)建

2.1.1 高效siRNA 序列篩選 分別用siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、NC-RNAi 轉(zhuǎn)染 J774A. 1 細(xì)胞，并設(shè)培養(yǎng)基空白對(duì)照組，RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示：3 組siRNA-IL-6 的IL-6 mRNA 相對(duì)表達(dá)量均明顯低于NC-RNAi 組和空白對(duì)照組，siRNA-1 的干擾效率達(dá)80.00%，siRNA-1 組IL-6 mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著低于siRNA-2和siRNA-3（F=58.74，P＜0.01，圖1）。

圖1 各組IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)水平Fig.1 IL-6 mRNA relative expression in each group

2.1.2 shRNA、重組慢病毒質(zhì)粒及目的基因的序列測(cè)定 PCR 鑒定感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化的載體質(zhì)粒，選取陽(yáng)性菌落，行2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示鑒定組分子量略高于空載質(zhì)粒對(duì)照組，說(shuō)明轉(zhuǎn)化成功（圖2）。PCR測(cè)序顯示插入的針對(duì)IL-6基因的siRNA核苷酸序列正確（圖3），結(jié)果表明成功構(gòu)建了沉默IL-6基因的慢病毒載體。

圖2 重組慢病毒質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoregram oflentiviralplasmid PCR products

圖3 重組慢病毒質(zhì)粒PCR測(cè)序Fig.3 Sequencing of recombinant lentivirus plasmid by PCR

2.2 LV-IL-6-RNAi 感染J774A. 1 細(xì)胞的病毒滴度及干擾效率測(cè)定 LV-IL-6-RNAi感染J774A.1細(xì)胞的滴度 MOI 分別為 1、10、100 時(shí)，200 倍顯微鏡下觀察顯示，J774A.1細(xì)胞表達(dá)GFP數(shù)占總細(xì)胞數(shù)分別為（72.56±2.19）%、（85.89±2.45）%、（47.65±2.06）%，MOI 為10 時(shí)感染效率顯著高于其他組（F=70.57，P＜0.01，圖4）。以最佳感染滴度LV-IL-6-RNAi感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期J774A. 1 細(xì)胞，IL-6 mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著低于LV-NC-RNAi 組及培養(yǎng)基空白對(duì)照組（F=33.47，P＜0.01）。IL-1β 和TNF-α mRNA 相對(duì)表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖5）。

圖4 LV-IL-6-RNAi感染J774A. 1細(xì)胞不同MOI值時(shí)GFP表達(dá)情況（×200）Fig.4 Expression of GFP in J774A. 1 cells infected by LV-IL-6-RNAi with different MOI（×200）

圖5 LV-IL-6-RNAi 及 LV-NC-RNAi 感染 J774A.1 細(xì)胞后IL-6、IL-1β及TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)Fig.5 Relative expressions of IL-6，IL-1β and TNF-α mRNA in J774A. 1 cells infected with LV-IL-6-RNAi and LV-NC-RNAi

2.3 LV-IL-6-RNAi治療CIA的效果

2.3.1 小鼠CIA 模型的構(gòu)建 注射Ⅱ型膠原及弗氏完全佐劑混合乳化液后第28~35 天，小鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫、活動(dòng)受限，多累及后肢足、踝和膝，但前爪也有受累。自第28 天起，關(guān)節(jié)炎評(píng)分顯著提高（t=3.83，P＜0.01，圖6A），成模率為96.43%。CIA 小鼠血清IL-6 水平顯著高于健康對(duì)照組（t=14.72，P＜0.01，圖6B）。CIA 小鼠和健康對(duì)照組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)分別為（207.70±11.04）個(gè)和（28.00±4.56）個(gè)（P＜0.01，圖6C、D）。

圖6 小鼠CIA模型構(gòu)建情況Fig.6 Construction of CIA mice model

2.3.2 LV-IL-6-RNAi 對(duì)CIA 關(guān)節(jié)炎評(píng)分的影響首次免疫注射第35 天后，CIA-LV-IL-6-RNAi 組及CIA-MTX組關(guān)節(jié)炎評(píng)分下降。首次免疫注射第42天，CIA-LV-IL-6-RNAi 組 、CIA-MTX 組 、CIA-LV-NCRNAi 組、CIA-PBS 組關(guān)節(jié)炎評(píng)分分別為（5.00±3.26）分、（5.28±2.22）分、（10.71±2.75）分、（9.86±1.34）分，CIA-LV-IL-6-RNAi 組關(guān)節(jié)炎評(píng)分顯著低于 CIA-LV-NC-RNAi 和 CIA-PBS 組（F=10.05，P＜0.01）。CIA-LV-IL-6-RNAi 組與 CIA-MTX 組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.19，P=0.85，圖7）。

圖7 各組CIA小鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分Fig.7 Arthritis score of CIA mice in each group

2.3.3 LV-IL-6-RNAi 對(duì) CIA 血 清 IL-6、IL-1β 和TNF-α 的影響 收集小鼠血清，ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示：正常健康組、CIA-PBS 組、CIA-LV-NC-RNAi 組、CIA-LV-IL-6-RNAi 組和 CIA-MTX 組血清 IL-6 水平分別為（28.37±12.35）pg/ml、（234.3±33.55）pg/ml、（272.7±28.46） pg/ml、（117.40±34.69） pg/ml、（158.60±23.97）pg/ml，CIA-LV-IL-6-RNAi 組 血 清IL-6水平顯著低于CIA-PBS組和CIA-LV-NC-RNAi組（F=87.29，P＜0.01）；CIA-LV-IL-6-RNAi 組與 CIAMTX 組血清IL-6 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.583，P=0.19，圖8A）。

正常健康組、CIA-PBS 組、CIA-LV-NC-RNAi 組、CIA-LV-IL-6-RNAi 組和 CIA-MTX 組血清 IL-1β 水平分別為（67.50±6.58）pg/ml、（477.4±58.13）pg/ml、（460.0±70.03）pg/ml、（184.3±24.80）pg/ml、（175.7±20.52）pg/ml，CIA-LV-IL-6-RNAi 組血清 IL-1β 水平顯著低于 CIA-PBS 組和 CIA-LV-NC-RNAi 組（F=18.20，P＜0.01）。CIA-LV-IL-6-RNAi 組與CIA-MTX組血清IL-1β 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.27，P=0.79，圖8B）。

正常健康組、CIA-PBS 組、CIA-LV-NC-RNAi 組、CIA-LV-IL-6-RNAi組和CIA-MTX組血清TNF-α水平分別為（53.58±11.96）pg/ml、（534.10±53.20）pg/ml、（601.00±40.07）pg/ml、（384.30±39.18）pg/ml、（417.80±33.91）pg/ml，CIA-LV-NC-RNAi 組血清 TNF-α 水平亦顯著低于CIA-PBS 組和CIA-LV-NC-RNAi 組（F=30.79，P＜0.01）。CIA-LV-IL-6-RNAi 組與CIA-MTX組血清TNF-α 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.65，P=0.99，圖8C）。

圖8 各組小鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平Fig.8 Serum IL-6，IL-1β and TNF-α levels of mice in each group

2.3.4 LV-IL-6-RNAi 治療 CIA 對(duì) CIA 關(guān)節(jié)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響 小鼠踝關(guān)節(jié)石蠟切片HE染色，400倍鏡下觀察結(jié)果顯示：健康組、CIA-PBS 組、CIA-LVNC-RNAi 組、CIA-LV-IL-6-RNAi 組和 CIA-MTX 組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)分別為（24.71±7.04）個(gè)、（173.00±17.14）個(gè)、（187.00±13.67）個(gè)、（91.71±18.03）個(gè)、（97.29±15.10）個(gè)，CIA-LV-IL-6-RNAi組和CIA-MTX組炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量均顯著少于CIA-LV-NC-RNAi組和 CIA-PBS 組（F=141.80，P＜0.01），而 CIA-LVIL-6-RNAi 組和CIA-MTX 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.63，P=0.54，圖9）。

圖9 各組小鼠踝關(guān)節(jié)切片HE染色和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)Fig.9 HE staining of ankle joint and number of infiltrating inflammatory cells of mice in each group

3 討論

基因治療已成為RA 最有前景的治療手段之一［8］。RNAi 涉及序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默，已成為一種主要的基因治療方法［9］。RNAi 通過(guò)轉(zhuǎn)染瞬時(shí)作用的siRNA 或通過(guò)載體導(dǎo)入穩(wěn)定的shRNA 實(shí)現(xiàn)。RNAi 治療的關(guān)鍵，是根據(jù)靶細(xì)胞選擇適當(dāng)靶點(diǎn)、載體及構(gòu)建高效的RNAi載體顆粒。

IL-6 是RA 發(fā)生、發(fā)展中主要促炎細(xì)胞因子，活化巨噬細(xì)胞是產(chǎn)生IL-6 的主要細(xì)胞，因此本文擬以巨噬細(xì)胞作為靶細(xì)胞、IL-6 作為治療靶點(diǎn)［10-15］。國(guó)外研究者用siRNA脂質(zhì)復(fù)合體特異性沉默IL-6治療CIA取得了令人鼓舞的結(jié)果［16］。本文擬通過(guò)導(dǎo)入穩(wěn)定的shRNA，長(zhǎng)期干擾巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-6 而達(dá)到抗炎治療作用。目前有多種載體用于攜帶shRNA，而慢病毒在多種細(xì)胞系中具有基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、外源基因穩(wěn)定整合、長(zhǎng)期表達(dá)、細(xì)胞毒性低的特點(diǎn)，已成功作為載體用于基因治療［17］。單核巨噬細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、胰腺細(xì)胞等是比較難以轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞系，目前常用的腺病毒載體對(duì)其感染率低，而慢病毒可轉(zhuǎn)染或感染單核巨噬細(xì)胞系，因此本研究以慢病毒為載體，構(gòu)建LV-IL-6-RNAi，進(jìn)行體外和體內(nèi)研究。

為確保IL-6 被特異性有效抑制，本研究設(shè)計(jì)并合成3 對(duì)針對(duì)IL-6 基因的siRNA 序列以及siRNA 陰性對(duì)照序列，采用巨噬細(xì)胞株J774A.1 檢測(cè)其敲低效率，結(jié)果顯示3 對(duì)針對(duì)IL-6 基因的siRNA 在J774A.1細(xì)胞中均能有效沉默IL-6基因，但靶向IL-6基因的 siRNA 不影響 J774A. 1 細(xì)胞 IL-1β 和 TNF-α mRNA 表達(dá)，說(shuō)明在體外J774A. 1 細(xì)胞水平，通過(guò)siRNA轉(zhuǎn)染瞬時(shí)作用，RNAi具有有效性及特異性［18］。篩選出敲低效率最高（80.00%）的IL-6 siRNA 序列，構(gòu)建shRNA、重組慢病毒質(zhì)粒、測(cè)序檢測(cè)驗(yàn)證后抽提質(zhì)粒，并進(jìn)行慢病毒包裝，構(gòu)建LV-IL-6-RNAi 病毒顆粒，穩(wěn)定沉默IL-6 并表達(dá)直接呈現(xiàn)病毒感染能力的GFP。為檢測(cè)LV-IL-6-RNAi 的安全性和更好把握LV-IL-6-RNAi 病毒顆粒小鼠體內(nèi)注射劑量，在體外J774A. 1 細(xì)胞水平進(jìn)行病毒顆粒滴度梯度實(shí)驗(yàn)，明場(chǎng)下觀察，感染滴度為1×108TU/ml的高滴度病毒感染72 h 后J774A. 1 細(xì)胞密度仍＞90%，說(shuō)明LV-IL-6-RNAi 具較好的安全性。暗場(chǎng)下觀察，表達(dá)GFP的J774A.1細(xì)胞在1×107TU/ml感染滴度下占比最高，說(shuō)明該滴度下LV-IL-6-RNAi感染能力最佳。

以慢病毒最佳感染滴度感染J774A. 1 細(xì)胞，LV-IL-6-RNAi組IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著低于LV-NC-RNAi組和培養(yǎng)基空白對(duì)照組，IL-1β和TNF-α mRNA 相對(duì)表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），再次說(shuō)明體外J774A.1細(xì)胞水平通過(guò)載體導(dǎo)入穩(wěn)定shRNA（LV-IL-6-RNAi）靶向 IL-6 的 RNAi 效果及特異性較好。RUBIN 等［19］利用不同病毒載體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性基因治療證實(shí)，慢病毒載體治療脫靶效應(yīng)低于其他病毒載體，結(jié)合本研究結(jié)果，再次提示慢病毒是一種針對(duì)巨噬細(xì)胞的高效實(shí)用性載體。以上結(jié)果表明，通過(guò)轉(zhuǎn)染瞬時(shí)作用的siRNA 及通過(guò)載體導(dǎo)入穩(wěn)定的shRNA（LV-IL-6-RNAi）在分子水平上實(shí)現(xiàn)了對(duì)巨噬細(xì)胞的RNAi作用。

CIA 在臨床表現(xiàn)、免疫病理等方面與人RA 類似，因而RA體內(nèi)實(shí)驗(yàn)性基礎(chǔ)研究以CIA作為研究對(duì)象。注射Ⅱ型膠原及弗氏完全佐劑混合乳化液后第28~35天，從關(guān)節(jié)表現(xiàn)、關(guān)節(jié)病理、血清學(xué)方面，均提示建模成功（成模率達(dá)96.43%），可用于體內(nèi)研究。

MTX 作為治療RA 的重要藥物，療效確切，因而被作為陽(yáng)性對(duì)照；治療局部關(guān)節(jié)炎癥理應(yīng)首選關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，但小鼠關(guān)節(jié)腔狹小，MTX 關(guān)節(jié)腔注射劑量相對(duì)較大，因此選擇MTX 腹腔注射可能更優(yōu)于關(guān)節(jié)腔注射［20-22］。

CIA 模型小鼠二次加強(qiáng)免疫注射前（首次免疫注射后第21 天），分別向4 各組小鼠對(duì)應(yīng)部位注射LV-IL-6-RNAi、LV-NC-RNAi、MTX、PBS 溶液，健康小鼠腹腔注射PBS，首次免疫注射后第28 天，CIA-LV-IL-6-RNAi組和CIA-MTX組關(guān)節(jié)炎評(píng)分增幅減弱；首次免疫注射后第35 天，CIA-LV-IL-6-RNAi組和CIA-MTX 組關(guān)節(jié)炎評(píng)分開始降低，關(guān)節(jié)炎評(píng)分隨時(shí)間而緩慢降低至首次免疫注射后第42天，而陰性對(duì)照、空白對(duì)照組的關(guān)節(jié)評(píng)分持續(xù)提高。提示LV-IL-6-RNAi 治療1 周內(nèi)起效，持續(xù)時(shí)間至少2 周以上。首次免疫注射后第42天，麻醉小鼠行心內(nèi)穿刺取血，檢測(cè)小鼠血清IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平，處死小鼠進(jìn)行病理檢查。CIA-LV-IL-6-RNAi 組和CIA-MTX 組血清 IL-6、IL-1β、TNF-α 水平及受累關(guān)節(jié)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)均顯著低于陰性對(duì)照、空白對(duì)照。CIA-LV-IL-6-RNAi 組與CIA-MTX 組在關(guān)節(jié)評(píng)分、血清細(xì)胞因子水平、受累關(guān)節(jié)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)三方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明LV-IL-6-RNAi 與1 mg/kg 的MTX 療效相當(dāng)。本研究從關(guān)節(jié)表現(xiàn)、血清細(xì)胞因子水平、關(guān)節(jié)病理上，均證實(shí)LV-IL-6-RNAi治療CIA的有效性，為RNAi技術(shù)從試驗(yàn)到臨床提供了有力支持?？紤]到CIA 存活時(shí)間問(wèn)題，本研究的LV-IL-6-RNAi 治療觀察時(shí)間僅為3 周，需后續(xù)研究探索其長(zhǎng)期療效。與傳統(tǒng)藥物相比，慢病毒基因治療無(wú)需反復(fù)多次應(yīng)用。另外，在體內(nèi)CIA 動(dòng)物水平方面，LV-IL-6-RNAi 雖然特異性干擾IL-6 表達(dá)，但由于細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)因素，同樣也間接影響其他炎癥因子如IL-1β和TNF-α表達(dá)，與體外J774A.1細(xì)胞水平RNAi方面特異性不同。

LV-IL-6-RNAi 實(shí)驗(yàn)基因治療RA 可行且有效。雖然RNAi 治療在基因水平發(fā)揮作用，與新興的針對(duì)細(xì)胞因子的生物制劑在蛋白水平進(jìn)行調(diào)控相比具有一定優(yōu)勢(shì)，但目前RNAi 治療仍處于試驗(yàn)階段，仍需大量基礎(chǔ)和臨床研究方能夠應(yīng)用于臨床。希望不久的將來(lái)，LV-IL-6-RNAi能夠盡快從試驗(yàn)走向臨床，為RA患者提供安全有效的治療。