韓運祺，肖云峰，王娜，田志杰

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010107； 2.內(nèi)蒙古大唐藥業(yè)，內(nèi)蒙古 阿拉善盟 750306

痛經(jīng)(primary dysmenorrhea)是女性經(jīng)期或行經(jīng)前后出現(xiàn)的周期性下腹疼痛，或痛引腰骶，可伴有惡心、嘔吐、冷汗淋漓、手足厥冷等癥狀，甚至劇痛暈厥[1]。臨床上，將痛經(jīng)分為原發(fā)性(primary dysmenorrhea，PD)痛經(jīng)和繼發(fā)性(secondary dysmenorrhea，SD)痛經(jīng)兩種[2]，影響世界上50%的女性，其中，10%的患者癥狀嚴(yán)重，是影響婦女正常工作和生活質(zhì)量的常見原因[3-4]。暖宮七味散現(xiàn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)蒙藥分冊，用于心、腎臟“赫依”病，氣滯腰痛，小腹冷痛，月經(jīng)不調(diào)，白帶過多等，具有調(diào)經(jīng)養(yǎng)血，暖宮止帶的功效。本實驗旨在研究比較暖宮七味散和暖宮七味膠囊對實驗性痛經(jīng)模型的鎮(zhèn)痛作用，并初步探討其機制。

蒙藥暖宮七味又名“蘇格木勒-7”由白豆蔻、天冬、手掌參、沉香、肉豆蔻、黃精、丁香七味蒙藥材組成[5]，常用于治療主因“赫依”引起的血功能失調(diào)，氣血功能受阻所致疾病“巴達干”“希拉烏蘇”凝滯型痛經(jīng)，蒙醫(yī)臨床多用于經(jīng)前、經(jīng)期小腹冷痛，月經(jīng)量少，色暗有塊，畏寒便溏，舌苔白膩，脈沉緊[6]。其中，黃精補氣，天冬養(yǎng)陰，肉豆蔻、白豆蔻固澀、溫中，丁香、沉香祛寒鎮(zhèn)痛，手掌參益腎健脾，理氣和血，諸藥合用，主治失血、帶下等癥[7]，暖宮七味的臨床使用效果良好，但缺少實驗研究基礎(chǔ)，鑒于此，本實驗旨在研究比較不同劑型的暖宮七味與0.2%鹽酸哌替啶為陽性藥的醋酸所致疼痛模型的鎮(zhèn)痛作用，為暖宮七味的臨床使用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級雌性，昆明小鼠(以下簡稱KM小鼠)，6～8周齡，80只，體質(zhì)量18～22 g，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(蒙)2020-0001，每5只飼養(yǎng)于1個飼養(yǎng)盒中，以北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供的SPF級大小鼠維持飼料喂食，飼養(yǎng)期間自由攝水，并控制飼養(yǎng)環(huán)境室溫為19～25 ℃、濕度為40%～60%。本實驗通過內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，批號YKD202102086。

清潔級，雌性日本大耳白兔6只，體質(zhì)量 1.5～2 kg，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(蒙)2020-0001，獨立飼養(yǎng)，自由攝食攝水，飼養(yǎng)環(huán)境室溫為(23±2) ℃，相對濕度50%～60%。

1.2 實驗藥物及試劑暖宮七味散(內(nèi)蒙古大唐藥業(yè)股份有限公司，批號：19664004)；暖宮七味膠囊(內(nèi)蒙古大唐藥業(yè)股份有限公司，批號：20191105)；鹽酸哌替啶注射液(湖北宜藥集團有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號：171109)；冰醋酸(天津市津東天正精細化學(xué)試劑廠，批號：20181124)；羧甲基纖維素鈉(以下簡稱CMC-Na，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20150026)；氯化鈉(天津市鼎盛鑫化工有限公司，批號：20190901)；氯化鉀(以下簡稱KCl，天津市鼎盛鑫化工有限公司，批號：20190311)；硫酸鎂(以下簡稱MgSO4·7H2O，上海埃彼化學(xué)試劑有限公司，批號：F20161013)；磷酸二氫鈉(以下簡稱NaH2PO4·2H2O，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20200529)；碳酸氫鈉(以下簡稱NaHCO3，天津市鼎盛鑫化工有限公司，批號：20190609)；氯化鈣(以下簡稱CaCl2，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號：20200612)；葡萄糖(無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司，批號：20180901)。

1.3 實驗儀器智能熱板儀(濟南益延科技發(fā)展有限公司，型號：YLS-6B)；生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司，型號：BL-420F)；電子天平(奧豪斯儀器上海有限公司，型號：AR224CN)；數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ-250DE)。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組取雌性KM小鼠80只，隨機分為空白組、陽性藥組、暖宮七味散低劑量組、暖宮七味散中劑量組、暖宮七味散高劑量組、暖宮七味膠囊低劑量組、暖宮七味膠囊中劑量組、暖宮七味膠囊高劑量組，每組10只。

日本大耳白兔6只，標(biāo)示為暖宮七味散低劑量組、暖宮七味散中劑量組、暖宮七味散高劑量組、暖宮七味膠囊低劑量組、暖宮七味膠囊中劑量組、暖宮七味膠囊高劑量組。

1.4.2 臺式液制備取NaCl 8 g、KCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.26 g、NaH2PO4·2H2O 0.065 g、NaHCO31 g、CaCl20.2 g、葡萄糖 1 g，先將CaCl2用蒸餾水溶解完全，再加入其余6種物質(zhì)溶解，轉(zhuǎn)移至1 000 mL量瓶中，蒸餾水定容。

1.4.3 離體兔腸實驗方法

1.4.3.1 離體兔腸藥物處理方法稱取0.42 g暖宮七味散及暖宮七味膠囊于10 mL蒸餾水中作為低劑量備用，稱取1.68 g暖宮七味散及暖宮七味膠囊于10 mL蒸餾水中作為高劑量備用，將準(zhǔn)備好的溶液于37 ℃、40 kHz超聲儀器中，超聲30 min，上層清液過濾紙，提取各組藥物有效成分。

灰色模型預(yù)測的優(yōu)點是利用較少的數(shù)據(jù)，就可以得到較為理想的預(yù)測結(jié)果，在信息貧乏、數(shù)據(jù)少時，相對于其他預(yù)測方法有其獨到之處。灰色預(yù)測模型有很多，可以統(tǒng)一表達為GM(h，n)。通常情況下，在建立灰色模型進行預(yù)測時，較適合的模型應(yīng)為單個變量模型，即GM(1，1)模型。該模型是一個變量、一階微分的數(shù)列預(yù)測模型，預(yù)測起來較簡單有效，應(yīng)用領(lǐng)域比較廣泛［2］。

1.4.3.2 離體兔腸動物處理方法參照兔離體腸平滑肌的實驗方法[8-10]，采用木棍敲擊日本大耳白兔后腦部位導(dǎo)致其死亡，立即剖開腹腔，找到胃后，剪取離胃幽門較近的一段十二指腸，放入預(yù)先處理的冷凍的臺氏液培養(yǎng)皿中，輕輕剝離腸系膜，用臺氏液將腸管的內(nèi)容物沖洗干凈，將腸管剪成約 2.0 cm 小段，放回冷凍臺氏液中作為標(biāo)本備用。取一小段標(biāo)本一端穿線固定于L型通氣鉤上，另一端連接到肌張力傳感器上，與BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)連接，然后將標(biāo)本懸吊于盛有臺氏液 (37 ℃±0.5 ℃，通氧)的離體器官浴槽中，通過肌張力傳感器、生物信號處理系統(tǒng)進行平滑肌張力檢測，調(diào)整腸肌力，觀察正常腸肌活動，待腸段自發(fā)性舒縮穩(wěn)定后，描記腸管正常運動曲線作為給藥前平均張力。

實驗時，用1 mL注射器吸取已經(jīng)配置好的提取物，每次給藥0.2 mL，臺式液對照組加入等體積的臺氏液，記錄曲線后，立即用新鮮臺氏液沖洗2～3次，待腸段舒縮恢復(fù)正常后才進行下一次給藥，無法恢復(fù)正常舒縮的腸段棄去，觀察并記錄給藥前后的曲線變化值。

1.5 熱板實驗方法將小鼠隨機分為空白組、陽性藥組、暖宮七味散劑低劑量組(0.78 g·kg-1)、暖宮七味散劑中劑量組(1.56 g·kg-1)、暖宮七味散劑高劑量組(2.18 g·kg-1)及暖宮七味膠囊劑低劑量組(0.78 g·kg-1)、暖宮七味膠囊劑中劑量組(1.56 g·kg-1)、暖宮七味膠囊劑高劑量組(2.18 g·kg-1)，空白組和陽性藥組給予同體積羧甲基纖維素鈉，其余各組給予相應(yīng)藥物灌胃15 d，末次給藥30 min后，空白組腹腔注射生理鹽水 0.1 mL·g-1，陽性藥組腹腔注射質(zhì)量濃度0.2%的鹽酸哌替啶溶液0.01 mL·g-1，30 min后分別將小鼠置于熱板儀(以小鼠第5次舔爪時間為標(biāo)準(zhǔn))，記錄小鼠疼痛閾值時間[11]。

1.6 醋酸扭體法將小鼠隨機分為空白組、陽性藥組、暖宮七味散低劑量組(0.78 g·kg-1)、暖宮七味散中劑量組(1.56 g·kg-1)、暖宮七味散高劑量組(2.18 g·kg-1)及暖宮七味膠囊低劑量組(0.78 g·kg-1)、暖宮七味膠囊中劑量組(1.56 g·kg-1)、暖宮七味膠囊高劑量組(2.18 g·kg-1)，空白組和陽性藥組給予同體積羧甲基纖維素鈉，其余各組給予相應(yīng)藥物灌胃15 d，末次給藥30 min后，空白組腹腔注射質(zhì)量濃度0.6%醋酸溶液0.2 mL復(fù)制小鼠疼痛模型，記錄從給藥后至小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)的時間。陽性藥組腹腔注射質(zhì)量濃度0.2%的鹽酸哌替啶溶液0.2 mL，給藥10 min后，腹腔注射0.2 mL質(zhì)量濃度0.6%醋酸溶液制造疼痛模型，記錄從給藥后至小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)的時間。暖宮七味散及暖宮七味膠囊組給藥后，腹腔注射質(zhì)量濃度0.6%醋酸溶液0.2 mL復(fù)制疼痛模型，記錄從給藥后至小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)的時間[12]。

2 結(jié)果

2.1 暖宮七味散各劑量對離體兔腸平滑肌的影響與給藥前比較，低劑量的暖宮七味散提取物后，平滑肌收縮明顯變化，其峰型穩(wěn)定平緩；與給藥前峰值比較，給予高劑量暖宮七味散提取物后，峰形不穩(wěn)，波動較大，對平滑肌收縮有作用，但作用不明顯，見圖1、圖2。

圖1 暖宮七味散低劑量對離體兔腸平滑肌的影響

圖2 暖宮七味散高劑量對離體兔腸平滑肌的影響

圖3 暖宮七味膠囊低劑量對離體兔腸平滑肌的影響

圖4 暖宮七味膠囊高劑量對離體兔腸平滑肌的影響

2.3 暖宮七味散各劑量疼痛閾值結(jié)果比較具體結(jié)果見表1。

表1 暖宮七味散各劑量疼痛閾值結(jié)果比較

2.4 暖宮七味膠囊各劑量疼痛閾值結(jié)果比較具體結(jié)果見表2。

表2 暖宮七味膠囊各劑量疼痛閾值結(jié)果比較

2.5 暖宮七味散各劑量醋酸扭體時間比較具體結(jié)果見表3。

表3 暖宮七味散各劑量醋酸扭體時間比較

2.6 暖宮七味膠囊各劑量醋酸扭體時間比較具體結(jié)果見表4。

表4 暖宮七味膠囊各劑量醋酸扭體時間比較

3 討論

目前，西醫(yī)治療原發(fā)性痛經(jīng)尚缺乏特效藥物，多采用雌孕激素，如安宮黃體酮片等[13]。以往的研究表明，該類藥物可有效抑制前列腺素釋放，避免前列腺素刺激子宮平滑肌收縮而引起血管痙攣，從而達到緩解疼痛的目的[14]。目前，化學(xué)藥物治療原發(fā)性痛經(jīng)的治療效率不夠理想，不良反應(yīng)較大，部分患者易復(fù)發(fā)[15]。

近年來，蒙醫(yī)蒙藥學(xué)在原發(fā)性痛經(jīng)治療中取得了顯著的進展，在蒙醫(yī)蒙藥學(xué)中，原發(fā)性痛經(jīng)的病機主要為外邪入侵，月經(jīng)不調(diào)，蒙古語名sa rin hir tegxgui，是指月經(jīng)周期、經(jīng)量、經(jīng)色、經(jīng)質(zhì)等方面有所改變的一類病癥[16]。蒙醫(yī)理論認為，月經(jīng)不調(diào)主要是由于巴達干、下清赫依功能失調(diào)，致使氣血運行受阻，引起腎及三舍二器的疾病[17-18]。治療原則以抑制赫依、活氣血、散寒止痛、暖宮調(diào)經(jīng)為原則[19-20]。蒙藥暖宮七味是一味蒙醫(yī)常用的治療原發(fā)性痛經(jīng)藥，方中肉豆蔻可理氣和中、補益腎陽；黃精、手掌參可補腎益氣、調(diào)經(jīng)止痛；丁香可溫中降逆、補腎助陽；沉香可行氣止痛；麥門冬可清心除煩、滋陰潤肺。諸藥合用，可調(diào)和氣血、散寒止痛、暖宮調(diào)經(jīng)[21]。有研究表明，蒙藥暖宮七味丸具有抑制心、腎“赫依”病的作用，能達到治療痛經(jīng)的目的[22]。研究表明，暖宮七味散可通過提高患者血清中的前列腺素來促進血管擴張和平滑肌的舒展[23]，不利于酸性代謝物的產(chǎn)生及其引起的神經(jīng)刺激產(chǎn)生，從而達到調(diào)節(jié)子宮微循環(huán)的目的。蒙醫(yī)研究治療痛經(jīng)藥物的藥效學(xué)研究時，常采用一些篩選試驗，常用的致痛方法有物理(熱、電、機械)和化學(xué)(冰醋酸、緩激肽、甲醛溶液)刺激法[24]。

本實驗中采用醋酸扭體法建立疼痛模型是將一定量的冰醋酸注入小鼠腹腔，刺激臟層和壁層腹膜，引起深部較大面積、較長時間的炎性疼痛，致使小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)[25]。雙側(cè)腹內(nèi)凹陷、伸展后肢、扭動爬行、蠕行等說明疼痛模型建立成功。該實驗方法是篩選鎮(zhèn)痛藥的一種較敏感、簡單、重復(fù)性好的化學(xué)刺激致痛方法。因此，凡是能解決以上病理因素導(dǎo)致疼痛的藥物均可起到一定的鎮(zhèn)痛效果。有研究顯示，醋酸介導(dǎo)的傷害性反應(yīng)是注射醋酸后腹腔pH值降低而直接刺激傷害傳入神經(jīng)纖維和炎性遞質(zhì)合成共同作用所致，因此，可認為本實驗?zāi)Ｐ团c中醫(yī)理論之外邪入侵留滯體內(nèi)導(dǎo)致氣血瘀滯不通而引起疼痛有相似之處[26]。蒙藥暖宮七味散及暖宮七味膠囊均可影響離體兔腸平滑肌的收縮，提高小鼠疼痛閾值，且暖宮七味散松弛平滑肌作用優(yōu)于暖宮七味膠囊；暖宮七味膠囊和暖宮七味散均能提高昆明種小鼠痛閾，延長小鼠的抗醋酸疼痛模型的時間，且暖宮七味散松弛鎮(zhèn)痛作用優(yōu)于暖宮七味膠囊。

綜上所述，暖宮七味散及暖宮七味膠囊均能提高小鼠的疼痛閾值時間，影響離體兔腸平滑肌收縮情況，具有明顯鎮(zhèn)痛作用，且暖宮七味散鎮(zhèn)痛作用優(yōu)于暖宮七味膠囊。