徐揚 吳駟東 錢臣 朱斌杰

骨關(guān)節(jié)炎 ( osteoarthritis，OA ) 作為臨床工作中最常見的關(guān)節(jié)退行性病變，其主要的臨床特征為關(guān)節(jié)疼痛、活動受限以及功能障礙。流行病學(xué)調(diào)查報告顯示，隨著年齡的增加，OA 的患病率也逐漸增加，75 歲以上年齡的患病率可高達 80%，嚴重影響了老年人的生活質(zhì)量。如何有效預(yù)防 OA 的發(fā)生發(fā)展，從 OA 的發(fā)生機制中及早進行干預(yù)是目前臨床研究的熱點與難點。

基礎(chǔ)研究結(jié)果顯示，OA 發(fā)病的主要病理學(xué)變化為關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的減少、骨贅形成以及滑膜無菌性的炎癥。而滑膜作為關(guān)節(jié)中內(nèi)部結(jié)構(gòu)與肌骨骼相互連接的橋梁，在維持關(guān)節(jié)的正常生理功能中發(fā)揮著重要的作用。研究顯示，滑膜組織可以通過分泌透明質(zhì)酸從而有效地保持關(guān)節(jié)面的潤滑程度，同時也可以有效地較少關(guān)節(jié)面的相互摩擦，為關(guān)節(jié)面的軟骨提供較好的保護作用。而隨著滑膜中巨噬細胞的形態(tài)功能改變，會進一步誘發(fā)甚至加重 OA的疾病進程。既往研究顯示，當滑膜組織中的巨噬細胞可以產(chǎn)生多種炎性因子并使其參與到 OA 的病程發(fā)展過程中，同時還與患者的疼痛、關(guān)節(jié)僵硬等臨床特征密切相關(guān)。但是，在 OA 患者中滑膜組織的具體分子調(diào)控機制尚未完全明晰，仍須進一步的深入研究。

近年來隨著基因芯片以及二代測序技術(shù)的普及，越來越多的基因測序被應(yīng)用到 OA 患者中，從而對于明確 OA 發(fā)生發(fā)展的具體分子調(diào)控機制提供了更多的理論工具。Shen 通過整合基因表達數(shù)據(jù)庫( gene expression omnibus，GEO ) 數(shù)據(jù)庫中關(guān)于 OA患者膝關(guān)節(jié)滑膜組織的基因芯片并通過生物信息學(xué)分析的方法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示 OA 主要的分子調(diào)控機制是通過絲裂原活化蛋白激酶、低氧誘導(dǎo)因子等信號通路的開關(guān)從而影響 OA 的疾病發(fā)展。但是，上述研究僅處于對 mRNA 的研究，具體 mRNA 在 OA 疾病中是如何被上級信號所調(diào)控的仍未有相關(guān)研究報道。

隨著研究的進一步深入，微小 RNA ( microRNA，miRNA ) 的概念也被相應(yīng)提出與證實。miRNA 作為細胞內(nèi)一類小的非編碼 RNA，可以通過調(diào)控其對應(yīng)靶基因的表達以及信號通路的開關(guān)，從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展。既往研究顯示，miRNA 在 OA 的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的調(diào)控作用。如 miR-146 可以通過降低 OA 滑膜成纖維細胞內(nèi)血管黏附分子-1 的表達，從而調(diào)控 OA 的發(fā)生；miR-602 可以通過調(diào)控滑膜成纖維細胞的血管生成活動，從而有效阻止OA 的發(fā)生發(fā)展。諸多研究結(jié)果都顯示，miRNA在 OA 的發(fā)生發(fā)展過程中都起到了重要的調(diào)控作用，但是既往研究往往僅針對某一單一 miRNA，缺乏整體性。而本研究擬通過生物信息學(xué)分析的方法有效篩選出 OA 患者滑膜組織內(nèi)差異表達的 mRNA和 miRNA 并以此構(gòu)建相應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，明確引起OA 發(fā)生的具體分子調(diào)控機制。

材料與方法

一、芯片數(shù)據(jù)的獲取

本研究中數(shù)據(jù)來源為從 GEO 獲取。mRNA 數(shù)據(jù)來源于 GEO 數(shù)據(jù)庫中的基因芯片數(shù)據(jù) GSE554457( 芯片平臺 GPL96 )，GSE554457 包含 33 例患者的滑膜組織數(shù)據(jù)，其中 10 例為健康滑膜組織，10 例為OA 患者膝關(guān)節(jié)滑膜組織；miRNA 數(shù)據(jù)來源于 GEO數(shù)據(jù)庫中的 RNA 測序數(shù)據(jù) GSE126677 ( 芯片平臺GPL167 )，一共包含 5 例患者的滑膜組織數(shù)據(jù)，其中 3 例為健康滑膜組織，2 例為 OA 患者膝關(guān)節(jié)滑膜組織。

二、獲取差異表達 miRNA / mRNA

差異表達 miRNA 和差異表達 mRNA 的獲取是基于 R 4.0.3 進行分析。使用 limma 加載包對獲取的mRNA 和 miRNA 數(shù)據(jù)進行標準化處理后通過設(shè)標準為＜ 0.05，|| ＞ 1 從而分別獲得差異表達的 miRNA 和 mRNA。通過 R 軟件中的 pheatmap 加載包繪制熱圖，ggplot2 加載包繪制火山圖可視化差異基因的表達情況。將差異表達的 mRNA 通過 string( string-db.org ) 建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并將獲得的網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入 Cytoscape 3.8.0 中進行可視化調(diào)整，最終呈現(xiàn)出差異表達 mRNA，通過 MCODE 插件篩選排名前三的關(guān)鍵模塊。

三、差異基因的功能富集分析

本研究中針對差異表達 mRNA 的功能富集分析主要是通過 Fun Rich 3.1.3 和 R 4.0.3 進行分析并繪圖。差異基因的功能富集分析主要是從三個方面對差異基因進行注釋：生物學(xué)過程 ( biological process，BP )、細胞組分 ( cell component，CC ) 和分子功能( molecular function，MF )，差異基因的富集通路分析主要是通過 DAVID ( ncifcrf.gov ) 進行。

四、差異 miRNA 的靶基因預(yù)測

通過 Fun Rich 3.1.3 對差異表達的 miRNA 進行靶基因的預(yù)測。

五、miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的可視化構(gòu)建

由于 miRNA 對于 mRNA 具有負向調(diào)控作用，本研究中首先通過差異表達的 miRNA 預(yù)測靶基因。將上調(diào)的 miRNA 預(yù)測靶基因與下調(diào)的差異表達mRNA，下調(diào)的 miRNA 與上調(diào)的差異表達 mRNA 分別取交集繪制韋恩圖 ( Veen ) 獲得在最終靶基因。根據(jù)靶基因和對于 miRNA 的相互作用關(guān)系在 Cytoscape中進行可視化分析。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

本研究統(tǒng)計學(xué)分析通過 R 4.0.3 進行，差異基因的篩選采用 R 4.0.3 的 Wilcox 檢驗。＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。設(shè)置差異基因的篩選標準為＜0.05，|| ＞ 1。

結(jié) 果

一、差異表達 mRNA 和 miRNA 的篩選

通過差異基因表達分析結(jié)果顯示，GSE126677包含 71 個差異表達的 miRNA，其中包含 9 個上調(diào)差異表達 miRNA 和 62 個下調(diào)差異表達 miRNA。GSE55457 中包含 874 個差異表達的 mRNA，其中包含 113 個下調(diào)差異表達 mRNA 以及 761 個上調(diào)差異表達 mRNA ( 圖 1 )。通過 Cytoscape 構(gòu)建差異表達mRNA 的蛋白可視化網(wǎng)絡(luò)同時通過 MCOD 篩選出三個關(guān)聯(lián)程度最高的模塊 ( 圖 2 )。

圖1 mRNA 與 miRNA 的差異表達基因分析圖 a：GSE55457 展示 OA 患者滑膜細胞差異表達 mRNA 熱圖分析；b：GSE126677 展示 OA患者滑膜細胞差異表達 miRNA 熱圖；c：GSE55457 展示 OA 患者滑膜細胞差異表達 mRNA 火山圖；d：GSE126677 展示 OA 患者滑膜細胞差異表達 miRNA 火山圖 ( 注：a、b 中的紅色表示高表達，藍色表示低表達；c、d 中的紅色表示上調(diào)基因，藍色表示下調(diào)基因，灰色表示無統(tǒng)計學(xué)差異的基因 )Fig.1 Analysis of differentially expressed genes between mRNA and miRNA a: mRNA thermomap of differential expression of synoviocytes of patients with osteoarthritis in GSE55457; b: miRNA thermomap of differentially expressed synoviocytes of patients with osteoarthritis in GSE126677; c: Volcanic map of differentially expressed mRNA of synoviocytes of patients with osteoarthritis in GSE55457; d: Volcanic map of differentially expressed miRNA of synoviocytes of patients with osteoarthritis in GSE126677 ( Notice: Red in figure a and b indicated high expression, while blue indicated low expression; red in figure c and d indicated up-regulated genes, blue indicated down-regulated genes, and gray indicated genes with no statistical differences )

圖2 差異表達的 mRNA 之間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖 ( PPI ) [ 注：a：差異表達基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，b、c、d：Cytoscape 3.8.0 中MCODE 插件篩選出來的關(guān)聯(lián)強度最高的 3 個模塊 ( 紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào) ) ]Fig.2 Protein interaction network map between differentially expressed mRNA ( PPI ) [ Notice: a: Protein interaction network of differentially expressed genes. b, c, d: The three modules with the highest correlation intensity selected by MCODE plug-ins in Cytoscape 3.8.0 ( red for up-regulation and green for down-regulation ) ]

二、差異表達 mRNA 的富集分析結(jié)果

通過 FunRich 對差異基因進行 GO 富集分析。結(jié)果顯示差異表達 mRNA 在細胞組分中主要存在于細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、血小板顆粒、質(zhì)膜、細胞核、細胞膜、細胞外基質(zhì)、細胞膜小窩；在分子功能中主要參與轉(zhuǎn)膜受體活動、轉(zhuǎn)錄調(diào)控活動、轉(zhuǎn)錄因子活動、酪氨酸蛋白、金屬離子結(jié)合、生長因子活性、細胞外基質(zhì)形成、細胞骨架蛋白結(jié)合、細胞骨架蛋白錨定活動、細胞粘連分子活動等過程中；在生物學(xué)進程中參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、堿基的調(diào)控、基因表達的調(diào)控、胰酶表達的調(diào)控、細胞遷移、細胞增殖、細胞交流以及細胞的錨定等進程中 ( 圖 3 )。而 KEGG富集通路分析結(jié)果顯示差異基因主要富集于 b1-整合素細胞表面相互作用、整合素家族細胞表面相互作用、血管內(nèi)皮生長因子 ( VEGF ) 和 VEGF 受體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及 CDC42 活動調(diào)控等信號通路中 ( 圖 4 )。

圖3 差異表達的 mRNA GO 功能富集分析 a：GO 富集分析展示差異基因富集于細胞組分的功能變化；b：GO 分析展示差異基因富集于分子功能的功能變化；c：GO 分析展示差異基因基于生物學(xué)過程的功能變化；d：氣泡圖描述細胞組分的變化情況；e：氣泡圖描述分子功能的功能變化；f：氣泡圖描述生物學(xué)過程的功能變化情況 ( 注：顏色表示差異基因的統(tǒng)計學(xué)意義，紅色表示統(tǒng)計學(xué)意義明顯，綠色表示統(tǒng)計學(xué)意義較低；大小表示富集于相應(yīng)功能的基因數(shù)目，越大表示富集的基因越多 )Fig.3 Functional enrichment analysis of mRNA a: GO functional enrichment analysis of differential expression showed that the functional changes of differential genes were enriched in cellular components; b: GO analysis showed functional changes of differential genes enriched in molecular function; c: GO analysis showed functional changes of differential genes based on biological processes; d: Bubble diagram described the changes of cell components; e: The bubble diagram described the functional changes of molecular functions; f: The bubble chart described the functional changes of biological processes ( Notice: Color indicated the statistical significance of differential genes. Red indicated statistically significant and green indicated statistically significant. Size indicates the number of genes enriched in the corresponding function. The larger the number of genes enriched, the more genes were enriched )

圖4 差異表達 mRNA 的富集通路分析Fig.4 Enrichment pathway analysis of differentially expressed mRNA

三、差異表達 miRNA 靶基因預(yù)測

利用 FunRich 3.1.3 中 miRNA Enrichment 的 Find targets 功能對獲取的差異表達的 miRNA 進行靶基因的預(yù)測，最終顯示 9 個 miRNA 可以預(yù)測出相應(yīng)的靶基因，而預(yù)測的靶基因總數(shù)為 2110 個。

四、構(gòu)建 miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

通過統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)最終獲取的 9 個 miRNA 都為上調(diào)的 RNA，則其預(yù)測的靶基因應(yīng)與下調(diào)的差異表達 mRNA 取交集，通過 Venn 圖繪制交集后共獲得19 個下調(diào)的差異表達 mRNA ( 圖 5 )，相關(guān)的 miRNA和 mRNA 表達情況詳見表 1?；?miRNA 與 mRNA的調(diào)控關(guān)系將各基因?qū)?Cytoscape 3.8.0 中構(gòu)建miRNA 差異 mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，具體網(wǎng)絡(luò)詳見圖 6。

圖6 miRNA-RNA 相互調(diào)控作用網(wǎng)絡(luò) ( 紅色表示上調(diào)，藍色表示下調(diào)，菱形為 miRNA，圓形為 mRNA，大小表示 logFC，logFC )Fig.6 miRNA-RNA interaction network ( Notice: Red indicated up-regulation and blue indicated down-regulation. The diamond was miRNA and the circle was mRNA. The size indicated that the bigger the logFC, logFC is, the bigger the shape is )

表1 具有潛在靶向作用關(guān)系的 miRNA 與 mRNA 表達情況Tab.1 miRNA and mRNA expression with potential targeting relationship

圖5 miRNA 預(yù)測靶基因與 GSE55457 下調(diào)基因的 Venn 圖Fig.5 Venn map of target genes predicted by miRNA and downregulated genes of GSE55457

討 論

既往研究結(jié)果顯示，miRNA 與 mRNA 在 OA 的發(fā)病過程中都起到了至關(guān)重要的調(diào)控作用。而本項研究通過分別分析兩組高通量測序數(shù)據(jù)并進行整合分析后，構(gòu)建了 OA 發(fā)病過程中的 miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對于 OA 的發(fā)病機制研究提供了更加可靠的理論依據(jù)。

一、mRNA 與 OA 的發(fā)生

GSE554457 為基因芯片技術(shù)獲得的 OA 患者與健康人膝關(guān)節(jié)滑膜組織的 mRNA 差異表達情況。GO 富集分析結(jié)果顯示，差異基因主要分布于細胞外基質(zhì)、細胞核的組分，轉(zhuǎn)錄因子、生長因子的活化以及細胞外基質(zhì)的形成上。細胞外基質(zhì)作為細胞外主要的屏障，可有效地保護細胞的活性，同時抵御機械壓力對于細胞的刺激、損傷，而細胞外基質(zhì)的合成與降解的異常會導(dǎo)致細胞的活性、功能明顯受損，最終引起OA 的發(fā)生發(fā)展，加重 OA 的病情。

KEGG 富集通路分析結(jié)果顯示差異基因主要富集于 b1-整合素細胞表面相互作用、整合素家族細胞表面相互作用、VEGF 和 VEGF 受體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及CDC42 活動調(diào)控等信號通路中。整合素作為黏附分子家族中的主要組成部分，其可介導(dǎo)細胞外的機械信號傳導(dǎo)至細胞內(nèi)，從而有效地抑制細胞外基質(zhì)的降解，促進細胞外基質(zhì)的合成，最終達到修復(fù)軟骨損傷的作用。而整合素的降低會明顯影響機械信號刺激的傳導(dǎo)，促進細胞外基質(zhì)的降解，最終誘導(dǎo) OA 的發(fā)生。而 VEGF 可以通過其特異性 VEGF受體作用于血管內(nèi)皮細胞，促進血管內(nèi)皮細胞的增生以及新生血管的形成，既往研究表明，VEGF 表達升高可以促進 OA 炎癥的發(fā)生發(fā)展以及關(guān)節(jié)軟骨重構(gòu)，加重 OA 患者的病情。

二、miRNA 與 OA 的發(fā)生

GSE126677 為 RNA 測序技術(shù)獲得的健康人膝關(guān)節(jié)滑膜組織以及 OA 患者膝關(guān)節(jié)滑膜組織的差異表達 miRNA，通過統(tǒng)計分析共獲得 72 個差異表達miRNA。通過 FunRich 預(yù)測靶基因功能顯示共 9 個上調(diào)的 miRNA 可以有效地預(yù)測出其靶基因 ( 表 1 )。將預(yù)測的靶基因與差異表達中下調(diào)的 mRNA 取交集后顯示 hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-140-5p 的靶向作用較多，同時差異性表達較強。既往研究結(jié)果顯示，has-miR-23b-3p在 OA 中表達明顯上升，同時 miR-23b-3p 的表達升高會增加血清中炎癥因子的表達、增加軟骨細胞的凋亡、抑制二型膠原蛋白的表達。Costa Viviana通過對比健康患者和 OA 患者膝關(guān)節(jié)組織 miR-31-5p的表達發(fā)現(xiàn)，miR-31-5p 可以通過調(diào)控縫隙連接蛋白 ( Cx43 ) 的影響成骨細胞以及軟骨細胞的表達，促進炎性因子的釋放，最終促進 OA 病程的發(fā)展。miR-140-5p 在 OA 的發(fā)生發(fā)展過程中的影響調(diào)控作用已得到多方研究驗證，有學(xué)者通過基礎(chǔ)實驗證實miR-140-5p 可以通過調(diào)控軟骨細胞內(nèi) NF-κB 的開關(guān)從而調(diào)控細胞外基質(zhì)的合成、降解，最終導(dǎo)致 OA的發(fā)生發(fā)展。hsa-miR-199a-5p 與 OA 發(fā)生的具體調(diào)控關(guān)系尚未被研究報道，需要進一步探索。

三、miRNA 靶向調(diào)控的 miRNA 與 OA 的發(fā)生

通過 miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可以發(fā)現(xiàn)，GAP43、HGF、SCRG1 與 miRNA 的關(guān)聯(lián)程度較高，為miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點。HGF 作為上游分子，其與 c-Met 結(jié)合后可以快速調(diào)控下游信號通路 ( PI3K / AKT、Ras / MAPK、JAK / STAT )的開關(guān)，從而影響細胞的功能與活性，最終引起OA 的發(fā)生發(fā)展。有學(xué)者通過大鼠實驗研究發(fā)現(xiàn)，c-Met / HGF 的激活可以促進 OA 大鼠滑膜組織功能的恢復(fù)。SCRG1 作為關(guān)節(jié)軟骨相關(guān)基因，在OA 的發(fā)生發(fā)展中也起到了主要的調(diào)控作用，Ochi Kensuke 通過基礎(chǔ)實驗顯示 SCRG1 可以促進軟骨細胞的形成，促進細胞外基質(zhì)的合成，抑制其降解。GAP43 與 OA 發(fā)生的具體調(diào)控關(guān)系尚未被研究報道，須進一步探索。

在 OA 的疾病發(fā)生中存在 miRNA-mRNA 相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作用，本研究初步建立了 OA 發(fā)生過程中miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對揭示 OA 發(fā)生發(fā)展的具體分子作用機制提供了強有力的理論參考依據(jù)。