武壯壯，申 振，武太勇，王佳妮，李 健，陳士偉，靳文軒，楊美菊，呂 智*

（1.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，山西太原 030001；2.晉城市人民醫(yī)院，山西晉城 048000；3.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030001）

骨肉瘤（osteosarcoma,OS）是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年，發(fā)病率為3～4例/100萬人，其惡性程度高、侵襲性強(qiáng)、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高［1～3］，嚴(yán)重影響青少年的健康。近年，隨著新輔助化療及外科技術(shù)水平的提高，OS的治療效果已有明顯改善，但局部復(fù)發(fā)率仍可高達(dá)50%，且有15%～20%患者在初診時(shí)已發(fā)生影像學(xué)可見的肺轉(zhuǎn)移，50%患者在治療期間出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，80%發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者在5年內(nèi)死亡［4］。腫瘤細(xì)胞在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)移大致經(jīng)過以下幾個(gè)步驟：（1）腫瘤細(xì)胞穿過宿主的血管外基質(zhì)進(jìn)入血管內(nèi)，而后進(jìn)入血液循環(huán)；（2）在血液循環(huán)中得以存活；（3）在血液循環(huán)中逃逸免疫系統(tǒng)的監(jiān)視；（4）到合適的靶器官后腫瘤細(xì)胞駐足并穿出血管壁；（5）腫瘤細(xì)胞粘附在靶器官并且在靶器官的微環(huán)境中得以存活；（6）隨著細(xì)胞的擴(kuò)增和腫瘤組織的長大，新生的腫瘤位點(diǎn)形成新生血管系統(tǒng)［5］。

以往研究表明，Necdin（NDN）是一種多功能蛋白質(zhì)，可以直接與DNA結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用［6］，也可以通過與E2F1、p53等著名的轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性以間接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄［7，8］。Chapman和Knowles［9］研究表明，NDN在癌細(xì)胞系和原發(fā)性腫瘤中都存在下調(diào)，這表明NDN可能具有腫瘤抑制作用。本研究旨在探討骨肉瘤患者組織中NDN是否表達(dá)異常及其與臨床病理因素和預(yù)后之間的潛在相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）四肢骨肉瘤；（2）符合美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）分期II期和Ⅲ期；（3）在本院行新輔助化療和根治性手術(shù)；（4）有活檢標(biāo)本，用于免疫組織化學(xué)染色。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）繼發(fā)性骨肉瘤；（2）骨外骨肉瘤；（3）骨膜或骨旁骨肉瘤；（4）患者術(shù)后未復(fù)查,無隨訪信息。

1.2 一般資料

2009年10月—2019年7月，山西醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨病科收治51例患者，符合上述標(biāo)準(zhǔn)，納入本研究。其中，男28例，女23例；年齡10～67歲，平均（27.04±17.40）歲。病理診斷為普通型骨肉瘤44例，軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤2例，毛細(xì)血管擴(kuò)張型骨肉瘤2例，巨細(xì)胞型骨肉瘤2例，低級(jí)別中央型骨肉瘤1例。Ennecking分期，ⅡA期34例，ⅡB期13例，Ⅲ期4例。本研究經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)［山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院委員會(huì)（2021）YX第（098）號(hào)］，均征得患者本人或法定監(jiān)護(hù)人的知情同意。

1.3 治療方法

先采用切開取活檢術(shù)，取少量組織進(jìn)行病檢，經(jīng)病理科兩位專家確診為骨肉瘤。待傷口愈合后2周開始進(jìn)行新輔助化療，鹽酸表柔比星：100 mg/m2，1次/d，連用3 d；順鉑：20 mg/m2，1次/d，連用5 d；術(shù)前化療2個(gè)療程。然后行瘤段切除假體重建術(shù)。瘤體送病檢，并檢測化療后腫瘤的壞死率。術(shù)后2周傷口愈合后拆線，并開始輔助化療。術(shù)后化療方案根據(jù)病檢中得出腫瘤壞死率來確定，如果壞死率＞90%，維持原化療方案；如果壞死率＜90%，改用異環(huán)磷酰胺1.5～2 g/m21次/d，連用5 d；順鉑30 mg/m2，1次/d，連用5 d。

1.4 免疫組織化學(xué)檢查

制備5 μ的石蠟切片，常規(guī)先行HE染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。然后行免疫組織化學(xué)檢測，二甲苯脫蠟，乙醇溶液復(fù)水，EDTA抗原修復(fù)液高壓修復(fù)。然后，用山羊血清封閉切片，用抗NDN抗體（Santa Cruz）在4℃孵育過夜。次日，切片用PBS洗滌3次，再與生物素標(biāo)記山羊抗小鼠/兔IgG（北京中杉金橋，37℃）孵育1 h，滴加SABC，37℃孵育30 min，然后用3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液（DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司）顯影，蘇木素溶液短暫染色，鹽酸酒精返藍(lán)，中性樹膠封片。使用Pannorama MIDI數(shù)字載玻片掃描儀和掃描儀控制軟件（3DHISTECH,Ltd.，布達(dá)佩斯，匈牙利）分析抗NDN染色的強(qiáng)度。

1.5 評(píng)價(jià)指標(biāo)

從手術(shù)之日到死亡之日或直到2021年3月，對臨床結(jié)果進(jìn)行跟蹤觀察。生存時(shí)間定義為從確診到死于原發(fā)腫瘤相關(guān)原因的時(shí)間跨度?；颊咝g(shù)后每3個(gè)月復(fù)查患肢X線片、胸部CT，每6個(gè)月復(fù)查全身骨掃描。記錄臨床病理變量，包括年齡、性別、初始磁共振圖像上腫瘤的最大直徑、Ennecking分期、局部復(fù)發(fā)、肺轉(zhuǎn)移。

免疫組化評(píng)定采用Image J圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行陽性結(jié)果判定。NDN分別以胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。將陽性細(xì)胞的積分光密度值（integrated optical density,IOD）分為：無色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，深棕色為3分。陽性面積百分比（染色面積），髙倍鏡（×400）下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，根據(jù)平均陽性細(xì)胞百分比分為：0%～25%為1分，26%-50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。兩項(xiàng)評(píng)分相乘：9＜強(qiáng)陽性≤12分,6＜陽性≤9分，3＜弱陽性≤6分，0≤陰性≤3分。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SAS 9.4軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Graphpad prism 7.0軟件統(tǒng)計(jì)圖繪制。計(jì)量資料以±s表示，資料呈正態(tài)分布時(shí)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析；資料呈非正態(tài)分布時(shí)，采用Mannwhitney U檢驗(yàn)或Krushal-Wallis H檢驗(yàn)。等級(jí)資料采用采用Krushal-Wallis H檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用Fisher確切概率法檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法估算生存率及平均生存期，Log-rank檢驗(yàn)不同組別生存率的差異，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床結(jié)果

本組51例患者均得到隨訪38以上，隨訪過程中，局部復(fù)發(fā)16例，轉(zhuǎn)移33例。末次隨訪時(shí)，無瘤生存10例，帶瘤生存5例，死亡36例。術(shù)后生存時(shí)間最長為78個(gè)月，最短者為16個(gè)月，絕大多數(shù)患者死亡原因?yàn)榉无D(zhuǎn)移以后導(dǎo)致的呼吸衰竭，以及出現(xiàn)轉(zhuǎn)移以后的全身惡病質(zhì)。

按末次隨訪結(jié)局分組（無瘤生存組、帶瘤生存組、死亡組）進(jìn)行比較，結(jié)果見表1，三組中年齡、性別、術(shù)前瘤體大小、NDN檢測差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。三組間骨肉瘤患者Ennecking分期比較，死亡組中IIB、III期所占比例明顯高于無瘤生存組和帶瘤生存組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。死亡組中肺轉(zhuǎn)移率明顯高于帶瘤生存組和無瘤生存組（P＜0.05）。

2.2 NDN免疫組化結(jié)果與分組比較

顯微鏡下所見見圖1，NDN表達(dá)主要位于細(xì)胞的胞核中。NDN在骨肉瘤組織中的表達(dá)率為29.41%（15/51），明顯低于瘤旁骨組織陽性表達(dá)率80.00%（8/10），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）。

圖1 NDN免疫組化染色所見 1a:瘤旁正常骨組織NDN表達(dá)呈陽性的細(xì)胞，被染成棕色（×40） 1b:高倍鏡下瘤旁正常骨組織NDN表達(dá)陽性的細(xì)胞，細(xì)胞核呈棕色，胞質(zhì)、胞核均被染成深棕色（×400） 1c:骨肉瘤組織NDN表達(dá)多呈陰性的細(xì)胞，骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核呈藍(lán)色（×40） 1d:高倍鏡下，可見部分蛋白表達(dá)陽性的細(xì)胞，胞質(zhì)、胞核均被染成淺棕色（×400）

按NDN檢測陰性與陽性分兩組進(jìn)行臨床比較，結(jié)果見表2。NDN蛋白表達(dá)陰性組的術(shù)前Ennecking分期為IIB、III期患者比例顯著高于陽性組（P＜0.05）。兩組年齡、性別、是否肺轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、是否復(fù)發(fā)、生存結(jié)局差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 NDN檢測陰性與陽性兩組患者資料與比較

2.3 不同組別平均生存時(shí)間比較

不同組別平均生存時(shí)間比較結(jié)果見表3，IIA期、非肺部轉(zhuǎn)移、腫瘤大?。? cm、NDN檢測陽性骨肉瘤患者平均生存時(shí)間顯著高于IIB/III期、肺部轉(zhuǎn)移、腫瘤大小≥5cm、NDN檢測陰性患者（P＜0.05）。

表3 Kaplan-Meier生存期及對數(shù)等級(jí)分析結(jié)果

不同骨肉瘤組織NDN表達(dá)陰性與陽性患者的Kaplan-Meier生存曲線見圖2，可見NDN陽性表達(dá)患者生存時(shí)間顯著長于NDN陰性表達(dá)患者。

圖2 NDN檢測陰性與陽性的Kaplan-Meier生存曲線

骨肉瘤患者Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果見表4，引入水準(zhǔn)為0.05，剔除水準(zhǔn)為0.1。結(jié)果表明，Ennecking分期 （HR=1.530）、肺轉(zhuǎn)移 （HR=4.662）、腫瘤大小（HR=3.398）是生存的危險(xiǎn)因素，而NDN陽性（HR=0.207）是生存的保護(hù)性因素。

表4 骨肉瘤生存風(fēng)險(xiǎn)的Cox多因素分析結(jié)果

3 討論

目前，骨肉瘤的治療手段主要是術(shù)前化療，手術(shù)治療，術(shù)后化療，但由于骨肉瘤的組織異質(zhì)性、遺傳不穩(wěn)定性、局部強(qiáng)侵襲性，大多數(shù)患者早期即出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，預(yù)后并不滿意。目前關(guān)于細(xì)胞起源的研究、OS干細(xì)胞特征的研究、各種信號(hào)傳導(dǎo)通路、腫瘤微環(huán)境、免疫治療等領(lǐng)域的深入研究，以及建立更好的疾病模型將會(huì)開辟治療此腫瘤的新思路，最終將會(huì)提高 OS 患者的療效［10］。

NDN是一種生長抑制蛋白，首次在有絲分裂后神經(jīng)元中被發(fā)現(xiàn)［11］。NDN最初被認(rèn)為是有絲分裂后神經(jīng)元細(xì)胞增殖的抑制因子，由于NDN的構(gòu)成性和終身表達(dá)，導(dǎo)致分化的神經(jīng)元永久退出細(xì)胞周期［12］。編碼人類NDN的基因位于染色體15q11上，這是普拉德-威利綜合征（Prader-Willi syndrome）的母系印記區(qū)域，是以發(fā)育遲緩和行為異常為特征的神經(jīng)遺傳學(xué)疾?。?1］。NDN基因是母系印記的，僅從父親的等位基因轉(zhuǎn)錄，在PWS患者中不表達(dá)。NDN是黑色素瘤抗原（MAGE）家族的成員，該家族由60多個(gè)共享高度保守的MAGE同源結(jié)構(gòu)域（MHD）的基因組成［13，14］。

Yang等［15］研究發(fā)現(xiàn)，NDN在正常卵巢上皮中持續(xù)表達(dá)，在大多數(shù)卵巢癌中表達(dá)下調(diào)。NDN的重新表達(dá)抑制了細(xì)胞的生長，降低了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和遷移性。Chapman等［16］的研究發(fā)現(xiàn)，在28個(gè)膀胱癌細(xì)胞系中有26個(gè)（92.9%）和58個(gè)膀胱癌腫瘤中有35個(gè)（60%）NDN轉(zhuǎn)錄本下調(diào)，并觀察到端粒酶催化亞單位hTERT可誘導(dǎo)正常人尿路上皮細(xì)胞NDN表達(dá)下調(diào)。膀胱癌細(xì)胞系和腫瘤提示NDN可能是腫瘤抑制基因。Hoek等［17］研究發(fā)現(xiàn)，與正常黑色素細(xì)胞相比，NDN在被測試的8個(gè)黑色素瘤細(xì)胞株中有6個(gè)下調(diào)，而在黑色素瘤細(xì)胞系中的異位重新表達(dá)導(dǎo)致了體外生長抑制，NDN的低表達(dá)仍然有利于腫瘤的生長，就像其他腫瘤抑制因子所顯示的那樣。Virani等［18］研究發(fā)現(xiàn)，NDN在一些腫瘤中高表達(dá)，并且有致癌的作用。NDN在不同的腫瘤中表現(xiàn)出不同的作用，可能與其所在的微環(huán)境和細(xì)胞環(huán)境有關(guān)［19］，了解其不同機(jī)制，對于NDN在腫瘤方面的研究非常重要。本研究發(fā)現(xiàn)，NDN在骨肉瘤組織中表達(dá)下調(diào)，在正常骨組織中高表達(dá)，NDN高表達(dá)的骨肉瘤患者，其生存率明顯高于NDN低表達(dá)的骨肉瘤患者。由此證明NDN在骨肉瘤中扮演著抑癌基因的角色。

骨肉瘤的轉(zhuǎn)移與Notch通路、Wnt/β-catenin信號(hào)通路、Src激酶、免疫逃逸、Fas信號(hào)通路等有關(guān)系［20］。Lee 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，乳腺癌中NDN的表達(dá)有所下降，這表明NDN可能發(fā)揮著腫瘤抑制因子的作用，NDN表達(dá)水平的提高抑制了高度侵襲性小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移能力，NDN很可能是作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和轉(zhuǎn)移抑制因子，在種系水平上發(fā)揮其影響。本研究應(yīng)用單因素和多因素生存分析發(fā)現(xiàn)，NDN表達(dá)、Ennecking分期、肺轉(zhuǎn)移是影響骨肉瘤患者預(yù)后的獨(dú)立因素，這表明NDN也可能通過抑制骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移來提高骨肉瘤患者的生存率。未來的研究方向應(yīng)該結(jié)合臨床，將靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)盡早轉(zhuǎn)化為臨床可用的新型靶向治療藥物以及加強(qiáng)對聯(lián)合用藥的探索以提高骨肉瘤化療療效。此外，提高腫瘤局部化療藥物濃度也可能是一種可行的策略［22］。本研究結(jié)果提示，NDN可能作為治療骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的一個(gè)靶點(diǎn)，其低表達(dá)是骨肉瘤患者預(yù)后不良的潛在指標(biāo)。