莫善平，陳榮發(fā)，范業(yè)賡，丘立杭，周慧文，周忠鳳，閆海鋒，鄧宇馳，羅 霆，吳建明

(廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院甘蔗研究所/農業(yè)農村部廣西甘蔗生物技術與遺傳改良重點實驗室/廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室/中國農業(yè)科學院甘蔗研究中心，廣西南寧 530007)

0 引言

甘蔗是我國最重要的糖料作物，蔗糖占中國食糖總產量90%以上，因此，甘蔗對中國的食糖供給和產銷平衡起到舉足輕重的作用。甘蔗是以收獲地上莖為主的糖料作物，適當調控節(jié)間伸長的比例是決定產量和糖分的關鍵。因此，深入研究甘蔗節(jié)間伸長相關酶動態(tài)變化的機理，對于提高甘蔗和蔗糖產量有重要意義。潘有強等[1-3]研究甘蔗節(jié)間Mg2＋、ATP酶活性、蛋白質含量與節(jié)間生長的關系，結果表明，從＋2到＋8節(jié)間，不同基因型節(jié)間長度的變化極為相似，從＋3到＋5、＋8節(jié)間，不同基因型的3種Mg2+、ATP酶活性、溶性蛋白質、細胞壁離子型結合蛋白質、細胞壁共價型結合蛋白質都逐漸下降，而可溶性總糖含量逐漸提高；甘蔗節(jié)間的α-葡萄糖苷酶和POD和β-半乳糖苷酶活性負調控節(jié)間伸長，α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶活性正調控節(jié)間伸長，鈣調素和β-甘露糖苷酶變化趨勢為單峰型[4]。前人研究結果表明，甘蔗節(jié)間相關酶在節(jié)間伸長過程中起著十分重要的作用，但其作用機理還未明確。

據(jù)Hamano等[5]研究表明，赤霉素可以促進卷心菜莖伸長和花蕾的伸長；Ross等[6]研究也表明，赤霉素伸進野生豌豆莖的伸長。許多研究均表明，赤霉素最突出的效應是刺激甘蔗莖的伸長[7-9]?？s節(jié)胺是赤霉素(Gibberellin，GA)生物合成抑制劑，通過降低內源GA水平減緩細胞伸長率及細胞分裂速率，進而縮短植株節(jié)間長度，使株型緊湊，防止植物旺長。因此，為了進一步揭示甘蔗節(jié)間伸長過程相關酶調控的生理機制，本研究以桂糖42號甘蔗品種為研究材料，通過分析赤霉素處理、縮節(jié)胺處理和清水處理三者的相關酶活性變化，以期為甘蔗節(jié)間伸長化學調控提供生理技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料準備

試驗在廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院甘蔗研究所進行。供試材料為節(jié)間較長的甘蔗優(yōu)良品種“桂糖42號”。2016年3月1～2日，選取桂糖42號芽體完好的蔗莖，將甘蔗砍成單芽莖段，并進行52℃恒溫水浴30 min脫毒處理，然后放進沙盤中進行育苗。隨后，選取株型和長勢相當?shù)亩~齡甘蔗幼苗移栽到塑料黑桶中(內徑35 cm，高50 cm)，栽培的土壤營養(yǎng)狀況為堿解氮89.6 mg/kg、有效磷48.82 mg/kg、速效鉀125 mg/kg、有機質25.6 g/kg、pH 5.38，每桶移栽甘蔗幼苗3株，用土量為20 kg，并以20 g復合肥作為基肥。緩苗5天后，隨機分為3組進行葉面噴施植物生長調節(jié)劑處理，選用GA3和DPC的濃度均為200 mg/L，以噴施清水為對照。待甘蔗長至12～13葉齡時，即伸長初期，選取長勢一致的甘蔗開始進行葉面噴施處理，以葉面欲滴水珠為度。分別于噴藥后第3、6、12和24天隨機采取各個處理的3株甘蔗新生的第一片真葉，每株甘蔗作為1個重復，擦凈后迅速投入液氮處理10 min，然后轉入-80℃超低溫保存，用于植物酶活性的測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 株高的測定

隨機選擇10株甘蔗，于處理后第3、6、12和24天測定清水對照、GA3和DPC處理后的甘蔗株高。

1.2.2 酶活性的測定

采用酶聯(lián)免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)測定植物NAD激酶(NADK)、鈣調素(CAM)、蛋白激酶(CDPKs)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、木葡聚糖內糖基轉移酶(XTH)和木葡聚糖內轉糖苷酶(XET)的活性；采用分光光度法測定N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(NAG)、α-半乳糖苷酶(α-GAL)、α-甘露糖苷酶(α-Manase)、α-葡萄糖苷酶(α-GC)、β-半乳糖苷酶(β-GAL)、β-甘露糖苷酶(β-Manase)、β-葡萄糖苷酶(β-GC)、果膠酶(Pectinase)和纖維素酶(Cellulase，CL)的活性；每個處理3次重復，技術重復測定3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 2019整理數(shù)據(jù)，用DPS 16.05軟件進行數(shù)據(jù)方差分析和LSD法顯著性檢驗，用GraphPad Prism 8.2作圖，圖表中的數(shù)值為均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 外源GA3和DPC處理對甘蔗株高的影響

植物生長調節(jié)劑與甘蔗生長發(fā)育密切相關，外源GA3和DPC處理對株高的調控作用正好相反，甘蔗株高表現(xiàn)為GA3＞CK＞DPC(圖1)。與同期葉面噴施清水對照(CK)相比，外源GA3處理后第3、6、12和24天的株高分別高于對照3.06%、17.58%、29.54%和18.51%，其中處理后第6、12和24天差異達顯著水平；而外源DPC處理后的株高一直低于對照，處理后第3、6、12和24天的株高分別低于對照1.27%、7.85%、8.07%和4.52%(圖1)。

圖1 噴施赤霉素和縮節(jié)胺對甘蔗株高的影響

2.2 外源GA3和DPC處理對甘蔗節(jié)間伸長過程中信號傳導因子的影響

由圖2可知，GA3處理明顯提高了NADK的活性，與同期葉面噴施清水對照(CK)相比，處理后第3、6、12和24天的NADK分別高于對照14.68%、7.83%、14.26%和10.06%；而DPC處理在第3天高于對照，在后面的時期卻明顯低于對照。對照處理、GA3處理和DPC處理的CAM活性都呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，GA3和DPC處理高于對照，GA3處理在第24天最高，GA3處理后第3、6、12和24天的CaM分別高于對照9.73%、13.32%、47.96%和33.21%，DPC處理后第3、6、12和24天的CaM分別高于對照14.61%、9.44%、21.32%和17.52%；對照、GA3和DPC的CAM呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，而GA3在第24天最高，且高于其他處理。GA3處理的CDPKs活性在第3天低于對照，隨著時間的增長明顯提高了CDPKs活性且高于對照，處理后第6、12和24天分別高于對照3.95%、5.70%和2.56%； 而DPC處理在整個時期均低于對照。

圖2 噴施赤霉素和縮節(jié)胺對甘蔗節(jié)間伸長過程中信號傳導因子的影響

2.3 外源GA3和DPC處理對甘蔗節(jié)間伸長過程中糖苷酶的影響

糖苷酶與植物細胞生長發(fā)育過程中壁的松馳或 加固有關，還與植物細胞的識別和一些信號分子的產生相聯(lián)系[10]。由圖3可以看出，整個處理期3個處理的α-GC活性呈現(xiàn)下降趨勢，對照與GA3處理的α-GC活性較為一致，而DPC處理卻明顯提高了α-GC活性；β-GC活性呈現(xiàn)上升趨勢，而GA3處理明顯抑制了β-GC活性，處理后第3、6、12和24天的β-GC活性分別低于對照21.24%、28.37%、20.29%和13.75%，而DPC處理卻提高了β-GC活性，處理后第3、6、12和24天的β-GC活性分別高于對照7.33%、3.86%、2.64%和9.98%。GA3處理的α-Manase活性呈現(xiàn)一個先上升后下降再上升的趨勢，處理后第24天達到峰值，為129.76 nmol/min/g.FW；而DPC處理α-Manase活性雖然呈上升趨勢，但是整個處理期都低于對照，說明DPC處理對α-Manase活性有抑制作用。整個處理期對照和DPC處理的β-Manase活性整體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，而GA3處理呈現(xiàn)整體上升后下降趨勢，處理后第12天到達峰值，為52.0 nmol/(min.g).FW，處理后第12天和第24天達顯著水平。

2.4 外源GA3和DPC處理對甘蔗節(jié)間伸長過程中胞壁松弛因子的影響

植物細胞要進行擴大生長，細胞壁就必須在一些酶蛋白的作用下進行修飾，引起細胞壁網(wǎng)絡結構松弛的主要因子有膨脹素、木葡聚糖內糖基轉移酶/水解酶(XTH)、纖維素酶(CL)、果膠酶(Pectinase)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)等[11]。由圖4可以看出整個處理期對照、GA3和DPC處理的CAT活性呈現(xiàn)上升趨勢，而GA3處理明顯抑制了CAT 活性，始終低于對照，處理后第3、6、12和24天的CAT活性分別低于對照13.62%、13.28%、11.93%和5.92%；而DPC處理卻提高了CAT活性，效果不明顯。GA3處理對POD活性的影響呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，處理后第3天低于對照，處理后第6～24天提高了POD活性，高于對照，且在處理后第24天到達高峰，整體來說GA3處理對POD活性變化影響不明顯，而DPC處理則明顯抑制了POD酶的活性。GA3處理明顯提高了XTH活性，在處理后第3、6、12和24天的XTH活性分別高于對照27.39%、29.74%、32.58%和23.93%，而DPC處理抑制了XTH酶的活性。GA3和DPC處理對果膠酶活性影響不大，3個處理呈現(xiàn)平穩(wěn)態(tài)勢，在處理后第3天GA3和DPC處理對果膠酶活雖然有所提高，但并不明顯，在處理后第6～24天GA3處理的果膠酶活性低于對照，而DPC處理出現(xiàn)先升后降趨勢。整個處理期對照、GA3和DPC處理的XET活性呈現(xiàn)上升趨勢，而GA3處理明顯抑制了XET酶活性，GA3處理后第3、6、12和24天的XET活性分別低于對照24.27%、25.86%、8.72%和6.63%；DPC處理明顯提高了XET酶活性，DPC處理后第3、6、12和24天的XET活性分別高于對照43.97%、62.63%、63.15%和40.96%。整個處理期對照、GA3和DPC的CL活性呈現(xiàn)上升趨勢，而DPC處理明顯抑制了CL酶活性，DPC處理后第3、6、12和24天的CL活性分別低于對照16.28%、36.46%、26.97%和16.82%；GA3處理明顯提高了CL酶活性，GA3處理后第6、12和24天的CL活性分別高于對照19.40%、13.01%和11.60%，在處理后第24天到達峰值，為757.57 nmol/(min.g).FW。

圖3 噴施赤霉素和縮節(jié)胺對甘蔗節(jié)間伸長過程中糖苷酶的影響

圖4 噴施赤霉素和縮節(jié)胺對甘蔗節(jié)間伸長過程中胞壁松弛因子的影響

3 討論

3.1 外源GA3和DPC處理下信號傳導因子與甘蔗節(jié)間伸長的關系

鈣調素(CaM)、NAD激酶(NADK)和鈣依賴蛋白激酶(CDPKs)是細胞內信號傳導的主要組分或起參與調節(jié)作用。NADK是受鈣調素(CaM)激活的重要酶之一[12]，鈣調素（也稱鈣調蛋白）是一種廣泛存在于真核生物中的鈣感受器, 參與各種生理活動的信號轉導。CaM生理功能的研究涉及面相當?shù)膹V泛，參與調控多種的生理功能。早期研究表明，外源CaM具有促進花粉萌發(fā)及花粉伸長，并能誘導特定基因的生理功能[13]。隨后研究還發(fā)現(xiàn)，花柱細胞外CaM對花粉在柱頭上的萌發(fā)起促進作用，對花粉管的伸長起促進作用[14-15]。本研究中3個處理發(fā)現(xiàn)CaM含量在處理后3天開始下降，然后在處理后6天隨著甘蔗節(jié)間伸長的生長而增加，到處理后24天GA3處理達到高峰，說明可能CaM動態(tài)性地響應細胞質Ca2+濃度的變化，最終產生刺激特異性的生理反應達到促進伸長的目的，CaM對于伸長起促進作用；這與前人研究CaM對花粉管的伸長起促進作用的結果相似。而DPC處理的CaM含量仍然高于對照卻低于GA3處理，這可能是外源刺激影響了CaM的活性，卻達不到GA3處理的效果。

NADK是植物細胞內CaM被Ca2+活化后所作用的重要靶酶之一。有研究表明在豌豆根尖伸長過程中，NADK活性和CaM含量都隨著伸長過程而變化[16]。王小菁等研究指出，紅光處理在引起綠豆下胚軸線粒體NADK活性增加的同時，胞質中活性CaM含量也相應增加[17]。到目前為止，還沒有直接研究證明NADK與節(jié)間伸長的關系。本研究結果表明，GA3處理明顯提高了活性，且隨著甘蔗節(jié)間伸長的生長呈現(xiàn)顯著增加的趨勢，而DPC處理的NADK活性低于對照；這說明，NADK可能通過影響甘蔗體內的CaM含量或活性氧物質進而調控甘蔗節(jié)間伸長。

CDPKs參與調控赤霉素(Gibberellin，GA)生物合成或信號通路[18]。CDPKs參與GA合成主要是通過影響GA20-氧化酶(GA20ox)和GA3-羥基化酶(GA3ox)來調控活性GA的合成。植物CDPKs參與了植物細胞肌動蛋白張力的調節(jié)、氣孔開放特征和植物的生長發(fā)育調節(jié)等[19-21]。CDPKs參與調控植物開花、花粉萌發(fā)及花粉管生長、種子發(fā)育等過程[22]。本研究結果表明，甘蔗幼莖的鈣依賴蛋白激酶(CDPKs)活性隨著節(jié)間伸長的生長呈顯著增加的趨勢，GA3處理明顯提高了CDPKs的活性，而DPC處理的CDPKs活性雖然隨著節(jié)間伸長的生長呈增加趨勢，但仍然低于對照處理；這說明GA3處理正調控了鈣依賴蛋白激酶(CDPKs)活性，DPC處理對CDPKs活性起到負調控作用。

3.2 外源GA3和DPC處理下糖苷酶與甘蔗節(jié)間伸長的關系

細胞壁的松弛是細胞伸長所必需，糖苷酶與細胞壁的松弛與延長[21]。本研究結果也發(fā)現(xiàn)，GA3處理的α-甘露糖苷酶(α-Manase)和β-甘露糖苷酶(β-Manase)活性呈現(xiàn)一個先上升后下降的趨勢，分別在處理后第24天和第12天達到峰值，且顯著高于對照，說明GA3提高了α-Manase和β-Manase的活性；而DPC處理明顯抑制了α-Manase和β-Manase的活性。GA3處理明顯抑制了α-葡萄糖苷酶(α-GC)和β-葡萄糖苷酶(β-GC)活性，尤其是β-葡萄糖苷酶(β-GC)活性顯著低于對照；而DPC處理卻明顯提高了α-葡萄糖苷酶(α-GC)和β-葡萄糖苷酶(β-GC)活性。說明α-甘露糖苷酶和β-甘露糖苷酶可能也通過影響細胞壁的松弛對甘蔗節(jié)間伸長具有正調控作用，但是它們作用時間和影響效果有差異。而α-葡萄糖苷酶(α-GC)和β-葡萄糖苷酶(β-GC)的活性正好相反，隨著甘蔗節(jié)間伸長而下降，但從未伸長期到伸長初期顯著下降后趨于平穩(wěn)，說明α-葡萄糖苷酶(α-GC)和β-葡萄糖苷酶(β-GC)在甘蔗節(jié)間伸長過程起著負調控的作用，但是作用時間主要是在未伸長期到伸長初期。

3.3 外源GA3和DPC處理下細胞壁松弛因子與甘蔗節(jié)間伸長的關系

植物節(jié)間的伸長是植物組織生長的結果，而植物細胞的伸長受制于細胞壁，植物要生長必須使細胞壁松馳與延長。植物細胞壁的松弛與伸展在調控細胞延伸生長方面具有重要作用[22]。研究還發(fā)現(xiàn)細胞壁松弛與延長還與羥基自由基(OH.)、H2O2等活性氧(ROS)對細胞壁多聚糖的切割有關[23-25]。植物體內O2-可以在POD作用下與H2O2反應生成OH.[26]，細胞壁中POD參與OH.形成[27]。H2O2處理細胞壁會使植物細胞壁中的自發(fā)熒光強度增強，酚類物質含量增加，從而增加細胞壁硬度，阻止細胞壁延伸[28]。而過氧化氫酶(CAT)活性與H2O2的活性氧有關[29-31]。POD、CAT是植物體內清除O2-和H2O2的重要保護酶，對H2O2的清除是促進植物代謝正常進行的基礎。陳芬[32]研究發(fā)現(xiàn)重瓣大花萱草噴施不同濃度赤霉素(GA3)處理均可提高花芽過氧化物酶(POD)活性，抑制過氧化氫酶(CAT)活性。

纖維素酶(Cellulase，CL)和果膠酶(Pectinase)是細胞壁重要的水解酶。有研究表明，促進細胞伸長是由于IAA促進H+分泌到細胞壁中并激活細胞壁中的纖維素酶，從而誘導纖維素降解導致細胞壁松弛所致[33]。本研究結果表明，纖維素酶活性隨著甘蔗節(jié)間伸長而增加，GA3處理顯著提高了纖維素酶的活性，差異達到顯著水平；而DPC處理卻抑制了纖維素酶活性，說明纖維素酶可能通過影響纖維素降解導致細胞松弛進而影響甘蔗節(jié)間伸長。果膠酶在節(jié)間伸長不同時期差異不大，GA3和DPC處理對果膠酶影響不大，3個處理在節(jié)間伸長期間無明顯差異，說明其對甘蔗節(jié)間伸長的影響不大。

木葡聚糖內轉糖苷酶(XET)和水解酶(XTH)廣泛地存在于植物的各種組織和細胞中，是植物細胞壁重構過程中的關鍵酶[34]。相關研究表明，木葡聚糖內轉糖基酶(XET)對于細胞壁松弛非常重要，在細胞的伸長中起主要作用[23,35]。在赤霉素 GA3 誘導下，萵苣和黃瓜下胚軸、豌豆節(jié)間和大麥葉片伸長生長的過程中，XET的酶活性顯著增強[36]。這說明在植物生長過程中 XTH 參與細胞壁松弛引起的細胞擴展伸長。本研究結果也表明，木葡聚糖內糖基轉移酶(XET)和水解酶(XTH)是隨著甘蔗節(jié)間伸長而增加，GA3顯著提高了XTH活性卻抑制了XET的活性，DPC卻顯著提高了XET活性，抑制了XTH活性。說明木葡聚糖內糖基轉移酶(XET)/水解酶(XTH)在調控甘蔗節(jié)間伸長過程中起著重要作用，而在GA3處理下更能有效提高XTH活性。

活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)是植物生長發(fā)育的重要調控因子，并直接參與細胞壁松弛和變硬的可塑性變化，影響細胞壁的特性，進而調節(jié)細胞的生長[28,37]，而過氧化氫酶和過氧化物酶均與活性氧(ROS)密切相關[38-39]。據(jù)研究不同條件下向日葵種子萌發(fā)過程中胚根伸長速率與活性氧清除系統(tǒng)中各酶的相關性表明：胚根的伸出與過氧化氫(CAT)活性呈顯著正相關[40]。之前我們的研究結果也表明，GA3處理后甘蔗節(jié)間得到伸長，過氧化氫酶也得到提高[39]。這些研究結果表明，過氧化氫對細胞或組織伸長具有促進作用。本研究結果也驗證了這個觀點，對照中CAT酶活性隨著甘蔗節(jié)間伸長而增加，雖然GA3處理抑制了CAT酶活性，DPC處理提高了CAT酶活性；說明，甘蔗伸長期是啟動植物生長的重要時期，植物體內代謝旺盛，產生的自由基增多，在這個時期甘蔗體內誘導合成了更多的CAT，去清除產生的大量自由基再到促進節(jié)間伸長的目的。過氧化物酶具有氧化分解吲哚乙酸的功能[41-42]，由于IAA在調節(jié)植物細胞伸長、頂端優(yōu)勢、生根、休眠、春花作用等方面具有重要作用，因此過氧化物酶與吲哚乙酸之比對植物的生理作用非常關鍵[43]。而相關的研究結果也表明，高粱、小麥、玉米伸長節(jié)間的過氧化物酶活性與株高呈負相關[43-45]；而我們之前的研究結果也表明，GA3處理后甘蔗節(jié)間得到伸長，過氧化物酶活性也相當下降。而本研究結果表明，甘蔗不同伸長期POD活性呈現(xiàn)先下降再上升的過程，在處理后24天前與甘蔗伸長呈現(xiàn)負相關關系；GA3處理有提高POD活性的效果，而DPC處理逐步抑制POD活性。這與前人研究高粱、小麥、玉米、甘蔗過氧化物酶活性與株高呈負相關的結果一致。

4 結論

本研究中GA3處理顯著提高了甘蔗株高，提高了NAD激酶(NADK)、鈣依賴蛋白激酶(CDPKs)、α-甘露糖苷酶(α-Manase)、β-甘露糖苷酶(β-Manase)、纖維素酶(CL)、木葡聚糖內糖基水解酶(XTH)和水解酶(XTH)活性，與甘蔗節(jié)間伸長呈顯著的正相關；而DPC處理株高明顯低于對照，但提高了鈣調素(CAM)、α-葡萄糖苷酶(α-GC)、β-葡萄糖苷酶(β-GC)、過氧化氫酶(CAT)和木葡聚糖內轉糖苷酶(XET)活性。GA3通過提高NAD激酶(NADK)和鈣依賴蛋白激酶(CDPKs)促進GA20-氧化酶(GA20ox)和GA3-羥基化酶(GA3ox)活性GA的合成，通過提高α-甘露糖苷酶(α-Manase)、β-甘露糖苷酶(β-Manase)、纖維素酶(CL)和酶木葡聚糖內糖基轉移酶(XET)活性促進節(jié)間細胞壁的松弛，從而促進甘蔗節(jié)間伸長；而DPC則對節(jié)間調控伸長起負調控作用。