孫千鴻 崔小燕 楊惠程

(昆明醫(yī)科大學(xué)海源學(xué)院 化學(xué)生化綜合實(shí)驗(yàn)室， 云南 昆明 651000)

八角金盤(FatsiaJaponicaThunb.Decne.etPlanch)為傘形目五加科八角金盤屬，本屬有兩種分布于日本和臺(tái)灣。目前國內(nèi)對(duì)其研究主要在園藝種植領(lǐng)域和藥用價(jià)值方面。最近研究主要集中在八角金盤籽油和果油的超聲波-微波協(xié)同提取及脂肪酸組成比較[1]，八角金盤莖、葉、花(果實(shí))中精油的化學(xué)成分分析[2]，八角金盤根、花和種子含三萜皂苷、常春藤苷元和多種果酸[3]及其花中黃酮[4]和果實(shí)色素的理化性質(zhì)研究[5],八角金盤在治療肝癌方面的研究[6]等，但對(duì)于八角金盤果實(shí)色素作為食品添加劑的可行性研究較少，為了進(jìn)一步確定該色素的安全性，本文進(jìn)行了動(dòng)物急毒性和抗氧化性研究。

1 材料

1.1 原料

八角金盤果實(shí)采摘于12月昆明醫(yī)科大學(xué)海源學(xué)院楊林校區(qū)種植區(qū)域，采用未進(jìn)行過任何殺蟲劑和化學(xué)肥料影響的植株，選飽滿黑色果為提取原料。

1.2 試劑

丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒均為南京建成生物工程研究所提供，乙醇為分析純，蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)昆明種小鼠，體重18～22 g雌、雄小鼠，均由具備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資質(zhì)的昆明艾尼莫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供。

1.4 儀器

美國奧豪斯PX224ZH電子分析天平、上海屹堯微波萃取儀XT-T6、上海美普達(dá)PV1可見分光光度計(jì)、德國普蘭德微量移液器、玻璃勻漿器、RE2000A上海亞容旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、TD6長(zhǎng)沙英泰離心機(jī)、循環(huán)水真空泵等。

2 方法

2.1 八角金盤果實(shí)色素的提取

采用微波輔助法提取八角金盤果實(shí)色素，前期處理果實(shí)為干燥顆粒，經(jīng)粉碎后(20目)過篩，提取液為酸性95%乙醇溶液，采用微波功率400 W，提取時(shí)間180 s，提取次數(shù)4次，料液比1∶60，粗提液過濾后通過大孔樹脂靜態(tài)吸附2 h后純化色素，色素液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)(45 ℃，80 r/m)。減壓狀態(tài)下，蒸發(fā)至凝膠狀后轉(zhuǎn)移到50 ℃的恒溫干燥箱進(jìn)行處理，將干燥后塊狀物做成粉劑備用。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和給藥

選用體重18～22 g、6～7周齡的昆明種小鼠、雌雄性各10只，隨機(jī)分組，采用寇氏法進(jìn)行劑量組的確定，可按照劑量等距設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組數(shù)，確定受試物劑量為1.008、1.814、3.265、5.877、10.578、19.041 g/kg，空白組采用蒸餾水(八角金盤果實(shí)色素采用蒸餾水配制)。

2.3 觀察指標(biāo)

預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行眼口鼻的刺激性觀察，判斷對(duì)皮膚的刺激性。按照劑量組計(jì)算每組給藥濃度進(jìn)行灌胃，實(shí)驗(yàn)前對(duì)動(dòng)物禁食16 h、正常飲水，以2 ml/100 g灌胃容量進(jìn)行灌胃，一天內(nèi)間隔6 h進(jìn)行3次灌胃，觀察14天后脫頸處死并進(jìn)行內(nèi)臟器官的觀察和生化指標(biāo)測(cè)定，同時(shí)完成動(dòng)物中毒癥狀和死亡數(shù)據(jù)的記錄。

2.3.1 體重指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)和記錄灌胃給藥后14天的變化，每天進(jìn)行稱重記錄，對(duì)一周和兩周指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.3.2 臟器系數(shù)

給藥后觀察14天脫頸處死，取肝、腎、肺、脾、心進(jìn)行質(zhì)量統(tǒng)計(jì)，進(jìn)行小鼠器官重量與體重的比值(mg/g),同時(shí)觀察各器官的組織變化。

2.3.3 抗氧化指標(biāo)檢測(cè)

主要針對(duì)小鼠肝組織進(jìn)行過氧化氫酶CAT、超氧化歧化酶SOD、丙二醛MDA的測(cè)定，對(duì)八角金盤果實(shí)色素在小鼠機(jī)體內(nèi)的抗氧化作用進(jìn)行初步評(píng)估。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行分析，不相同的實(shí)驗(yàn)組使用單因素方差分析，相關(guān)性數(shù)據(jù)使用IBM SPSS statistics26軟件處理，p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 分組給藥后動(dòng)物死亡情況和LD50確定

灌胃后觀察動(dòng)物中毒表現(xiàn)，按照規(guī)范要求進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)記錄，連續(xù)14天觀察動(dòng)物體重、死亡數(shù)量及解剖所見，如表1所示。

表1 八角金盤果實(shí)色素對(duì)小鼠的急毒性分析Tab. 1 Effects of extract from berries of Fatsja japonica bark on acute toxicity study of mice

根據(jù)寇氏法[7]的要求設(shè)計(jì)5～10組，每組動(dòng)物數(shù)量6～10只。劑量通過最小劑量和最大劑量之差進(jìn)行對(duì)數(shù)等距分組，計(jì)算LD50及95%平均可信限。實(shí)驗(yàn)滿足全死亡和零死亡的劑量設(shè)計(jì)，使用計(jì)算公式log LD50=Xm-i(∑P-0.5)，95%平均可信限為log-1(log LD50±1.96Slog LD50),Sx50是log LD50的標(biāo)準(zhǔn)誤差。八角金盤果實(shí)色素LD50為7.017 8 g/kg，Sx50為0.065 5，95%可信限為5.222 g/kg～9.432 g/kg，根據(jù)食品安全毒理學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，判斷八角金盤果實(shí)色素屬于實(shí)際無毒級(jí)。

3.2 體重

灌胃后14天觀察記錄小鼠體重變化，通過與空白組對(duì)照和觀察(如表2所示)，在受試物19.041 g/kg大劑量灌胃組出現(xiàn)較為明顯的體重和進(jìn)食減少，精神狀態(tài)不佳，在8天后有明顯恢復(fù)，因此大劑量的受試物對(duì)小鼠體重有一定影響。雌性和雄性小鼠在體重變化上p>0.05未出現(xiàn)明顯差異。空白組與高劑量組體重統(tǒng)計(jì)差值的顯著性p<0.05，說明高劑量的受試物對(duì)小鼠體重的影響明顯。同時(shí)由于觀察時(shí)間較短，體重統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，建議延長(zhǎng)觀察時(shí)間有利于受試物和體重的統(tǒng)計(jì)關(guān)系更準(zhǔn)確。

表2 八角金盤果實(shí)色素對(duì)小鼠體重的影響Tab. 2 Effects of extract from Fatsja japonica on bady weights of mice

3.3 臟器系數(shù)

臟器系數(shù)是毒理實(shí)驗(yàn)中常用指標(biāo)，可利用肝、腎、肺、脾、心的重量與動(dòng)物體重比值，評(píng)價(jià)受試物對(duì)動(dòng)物臟器影響程度。對(duì)比正常時(shí)與染毒后各臟器與體重的比值的變化，對(duì)臟器系數(shù)增大的情況，判斷是否伴隨臟器充血、水腫或增生肥大等可能性；臟器系數(shù)減小，具有臟器萎縮及其他退行性改變的可能。從表3可見八角金盤果實(shí)色素對(duì)小鼠心、肝、腎、脾和肺的影響在與空白組對(duì)照中，表現(xiàn)出高劑量組19.041 g/kg、10.578 g/kg)的脾臟系數(shù)p<0.01有顯著差異性。說明大劑量灌胃受試物后小鼠脾臟有腫大情況，觀察有部分小鼠脾臟顏色稍有加深，不排除色素對(duì)脾臟有一定的影響。雌雄小鼠的臟器系數(shù)對(duì)比未見明顯差異，說明八角金盤果實(shí)色素的作用受小鼠性別影響不大。

表3 八角金盤果實(shí)色素對(duì)小鼠主要臟器系數(shù)的影響Tab. 3 Effects of extract fromFatsja japonica on mice of viscera/body weight

3.4 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

通過對(duì)肝組織的抗氧化指標(biāo)的檢測(cè)，進(jìn)一步探究八角金盤果實(shí)色素對(duì)小鼠體內(nèi)自由基的清除是否有幫助，對(duì)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度和催化細(xì)胞內(nèi)過氧化氫分解防氧化是否具有影響。為了減小誤差，采用取量比較大的肝臟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)測(cè)試盒要求進(jìn)行10%肝組織勻漿液的制備，通過勻漿濃度曲線選擇最佳取樣濃度為1%，測(cè)定總蛋白量后開始過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)三個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)，結(jié)果如表4所示。

表4 八角金盤果實(shí)色素對(duì)小鼠機(jī)體抗氧化能力的影響Tab. 4 Effects of extract from Fatsja japonica bark on oxidation resistance

從表4中可見三個(gè)指標(biāo)在雌雄動(dòng)物的對(duì)比p>0.05，無顯著性差異。隨著八角金盤果實(shí)色素劑量的增加，CAT值顯著增加，尤其在大劑量灌胃后數(shù)值與空白組對(duì)比p<0.01，有顯著差異性變化。說明八角金盤果實(shí)色素可促進(jìn)機(jī)體過氧化氫酶的產(chǎn)生，顯現(xiàn)出該色素對(duì)小鼠機(jī)體具有抗氧化的能力。同時(shí)SOD活性值表現(xiàn)出先升高后降低的情況，分析可見其在5.877 g/kg劑量組后再增加受試物劑量，SOD活性明顯低于空白組(p<0.01)。小鼠肝臟中MDA含量隨受試物劑量的增加而升高，在高劑量與空白組對(duì)比(p<0.01)有顯著性表現(xiàn)。分析八角金盤果實(shí)色素在小鼠機(jī)體內(nèi)抗氧化性與受試物劑量有相關(guān)性，同時(shí)高劑量灌胃后，小鼠機(jī)體表現(xiàn)出抗氧化性的抑制作用和體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度增加。

4 討論

八角金盤果實(shí)色素經(jīng)灌胃進(jìn)行急毒性實(shí)驗(yàn)，測(cè)定出LD50為7.0178 g/kg，Sx50為0.065 5,95%，可信限為5.222 g/kg～9.432 g/kg，依據(jù)急性毒性劑量分級(jí)為實(shí)際無毒級(jí)。

八角金盤果實(shí)色素在灌胃之后，大劑量組出現(xiàn)食欲不振情況，同時(shí)根據(jù)體重?cái)?shù)據(jù)分析說明大劑量灌胃后對(duì)小鼠的體重增長(zhǎng)有影響。對(duì)小鼠臟器系數(shù)的分析和器官形態(tài)的觀察結(jié)果，說明八角金盤果實(shí)色素對(duì)脾臟有一定影響，具體影響因素有待進(jìn)一步研究。同時(shí)對(duì)小鼠肝臟中過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表示八角金盤果實(shí)色素的抗氧化性在小鼠機(jī)體內(nèi)表現(xiàn)出低劑量有積極的抗氧化性，超過一定劑量后出現(xiàn)抑制作用和過氧化脂質(zhì)程度明顯，說明抗氧化性與受試物有明顯劑量關(guān)系。由于三個(gè)指標(biāo)分析中標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，初步分析可能由于給藥時(shí)間和觀察時(shí)間較短，部分抗氧化指標(biāo)和成分還來不及代謝就進(jìn)行檢測(cè)導(dǎo)致存在誤差。建議后期抗氧化指標(biāo)檢測(cè)可以在喂養(yǎng)28天實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行，可保證數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確。同時(shí)在多個(gè)指標(biāo)的測(cè)定中，雌雄小鼠的性別差異性較小，可為后期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析作參考。