袁遠(yuǎn)宏 張慧 肖政輝 張新萍 盧秀蘭 胥志躍 尹強(qiáng) 陳衛(wèi)堅(jiān) 賀杰

1湖南省兒童醫(yī)院急救中心，長沙 410007；2湖南省兒童醫(yī)院肝病中心，長沙 410007；3湖南省兒童醫(yī)院普外科，長沙 410007；4湖南省兒童醫(yī)院病理科，長沙 410007

抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)（antibody mediated rejection，AMR）是導(dǎo)致晚期移植物功能喪失的主要原因之一。肝移植是兒童肝病終末期常規(guī)治療手段，肝臟作為一個免疫器官，既往認(rèn)為較少發(fā)生排斥反應(yīng)。隨著肝移植數(shù)量的增加，移植后出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)的病例數(shù)也越來越多，但多為細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)，急性AMR發(fā)病率很低，對AMR診斷和治療的認(rèn)識也相對不足，目前缺乏明確的治療方案，常規(guī)抗排斥反應(yīng)治療的效果不太理想，可導(dǎo)致移植肝功能衰竭或二次肝移植［1］。本研究回顧性分析湖南省兒童醫(yī)院利用血漿置換救治成功的1例兒童親屬活體肝移植、術(shù)后發(fā)生AMR受者的臨床資料，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)復(fù)習(xí)探討AMR的更有效診治方案。

材料與方法

一、一般資料

研究對象為2017年12月湖南省兒童醫(yī)院收治的1例行親屬活體肝移植術(shù)后出現(xiàn)AMR的男性患兒，手術(shù)時(shí)年齡為7個月，原發(fā)病為膽道閉鎖（biliary atresia，BA）、膽汁性肝硬化。由湖南省兒童醫(yī)院兒童肝移植團(tuán)隊(duì)和中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院器官移植中心合作完成活體肝臟移植手術(shù)，供肝者為患兒母親，移植肝為供肝的左外葉，手術(shù)方式為背馱式肝移植。膽道重建采取Roux-en-Y膽腸吻合，手術(shù)過程順利，術(shù)后第3天由湘雅二醫(yī)院器官移植中心轉(zhuǎn)入湖南省兒童醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室。本研究經(jīng)湖南省兒童醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)（HCHLL-2020-54）

二、治療方法

1.常規(guī)治療：包括抗感染、免疫抑制。①抗感染：術(shù)后先后予亞胺培南、萬古霉素、甲硝唑和更昔洛韋聯(lián)合抗感染；術(shù)后第8天出現(xiàn)發(fā)熱，停用甲硝唑，加用頭孢哌酮舒巴坦鈉抗感染。術(shù)后第13天患兒出現(xiàn)嚴(yán)重肺部感染、右側(cè)膿氣胸，胸腔積液培養(yǎng)檢出肺炎克雷伯菌，停萬古霉素改阿米卡星抗感染，并加用卡泊芬凈抗真菌。②免疫抑制：術(shù)后一直口服他克莫司＋潑尼松二聯(lián)抗排斥治療，他克莫司目標(biāo)濃度維持在6～8 ng/mL，術(shù)后第13天因嚴(yán)重肺部感染，間斷停用他克莫司。術(shù)后第14天出現(xiàn)以膽紅素升高為主的肝功能損害，術(shù)后第24天總膽紅素升至196μmol/L，直接膽紅素96.10μmol/L，間接膽紅素100.03μmol/L。完善血液人類白細(xì)胞抗原（human lymphocyte antigen，HLA）等檢查，HLA-Ⅰ陰性，HLA-Ⅱ類特異性抗體陽性；供體的HLA血液檢測結(jié)果為陽性。經(jīng)與供體HLA配型比對后發(fā)現(xiàn)存在供體特異性抗體（donor specific antibody，DSA），為HLA-DQ抗體，平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）為10 705，血液PRAⅠ類陰性，PRAⅡ類陽性；行移植肝組織穿刺活檢顯示中-重度急性排斥反應(yīng)，C4d染色陽性。結(jié)合臨床表現(xiàn)，考慮存在抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)，予甲強(qiáng)龍靜脈沖擊＋靜脈丙種球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）＋嗎替麥考酚脂加強(qiáng)抗排斥反應(yīng)，后調(diào)整相關(guān)免疫抑制藥物劑量。

2.血漿置換治療：術(shù)后第29天開始使用血漿置換治療，每2天1次，共置換5次。采用金寶Prismaflex血液凈化機(jī)，采用旭化成Plasmaflo OP-02W-膜式血漿分離器，經(jīng)左股靜脈置入雙腔透析導(dǎo)管（管徑6.5F），每次置換新鮮冰凍血漿量為50～100 mL/kg，設(shè)置血流速度為5～10 mL·kg-1·min-1，血漿置換速度為血流速度的20%～25%，以肝素鹽水預(yù)充管路，持續(xù)泵人普通肝素10 U·kg-1·h-1，每次床旁治療時(shí)間2～3 h。術(shù)后24 h內(nèi)監(jiān)測肝功能、血常規(guī)、凝血功能等指標(biāo)。

3.抗體介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)診斷標(biāo)準(zhǔn)：①與急性AMR一致的組織病理學(xué)表現(xiàn)；②血清DSA陽性；③C4d彌漫性沉浸于微血管或門脈基質(zhì)；④排除其他可引起類似病理改變的疾?。?］。

結(jié) 果

一、血漿置換治療1周后相關(guān)指標(biāo)情況

第1次血漿置換治療后總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、間接膽紅素（indirect bilirubin，IBIL）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）下降，4 h后有所反彈；第2次血漿置換治療后未出現(xiàn)明顯反彈，TBIL、DBIL、IBIL均逐步下降，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alamine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）均有下降；紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）、白細(xì)胞（white blood cell，WBC）、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）指標(biāo)變化不明顯（血漿置換期間有輸注紅細(xì)胞懸液），血小板（platelet，PLT）稍有下降。見表1。

表1 親屬活體肝移植患兒第1至第5次血漿置換術(shù)前及術(shù)后部分實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)變化Table 1 Changes of some laboratory test parameters before and after plasmapheresis in children

二、移植肝穿刺活檢病理情況

術(shù)后第24天第1次完善移植肝穿刺活檢病理檢查（圖1），鏡下見肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝竇索結(jié)構(gòu)欠清楚。大部分肝細(xì)胞明顯水腫，空泡變性。少數(shù)肝細(xì)胞壞死、較多肝細(xì)胞胞漿可見淤膽。肝細(xì)胞核大小不一、可見多核肝細(xì)胞。匯管區(qū)可見大量混合性炎癥細(xì)胞浸潤，膽管壁可見炎癥細(xì)胞浸潤，血管壁可見血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，個別壞死。匯管區(qū)旁肝細(xì)胞間可見散在炎癥細(xì)胞浸潤。特殊染色VG及MASSON染色顯示肝組織內(nèi)纖維組織輕度增生，示中-重度急性排斥反應(yīng)。術(shù)后第37天第2次復(fù)查移植肝活檢（圖2），肝細(xì)胞內(nèi)明顯膽汁淤積，C4d在肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞可見弱陽性表達(dá)。免疫組化結(jié)果：Vim（-）、CK（＋）、CK19（＋）、CMV（-）、C4d（弱＋）、Ki-67（-）。分別于術(shù)后第47天（圖3）、術(shù)后第4個月（圖4）、術(shù)后第10個月（圖5）、術(shù)后第16個月（圖6）4次復(fù)查移植肝穿刺活檢病理檢查，提示排斥反應(yīng)逐步減輕，未出現(xiàn)AMR復(fù)發(fā)。

圖1 肝移植術(shù)后24天第1次移植肝組織病理學(xué)特征及免疫組織學(xué)染色（HE染色，×400） 肝細(xì)胞明顯水腫，空泡變性，少數(shù)壞死；匯管區(qū)見混合性炎癥細(xì)胞浸潤；膽管壁炎癥細(xì)胞浸潤；血管壁血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，個別壞死 圖2 肝移植術(shù)后37天第2次移植肝組織病理學(xué)特征及免疫組織學(xué)染色（HE染色，×400） 肝細(xì)胞輕度水腫；肝細(xì)胞內(nèi)明顯膽汁淤積，C4d在肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞可見弱陽性表達(dá)；匯管區(qū)可見少量混合性炎癥細(xì)胞浸潤 圖3 肝移植術(shù)后47天第3次移植肝組織病理學(xué)特征及免疫組織學(xué)染色（HE染色，×400） 部分肝細(xì)胞水腫，空泡變性；肝細(xì)胞胞漿及肝竇內(nèi)可見淤膽；匯管區(qū)可見少量淋巴細(xì)胞浸潤 圖4 肝移植術(shù)后4個月第4次移植肝組織病理學(xué)特征及免疫組織學(xué)染色（HE染色，×400） 少數(shù)肝細(xì)胞水腫，空泡變性；肝細(xì)胞胞漿及肝竇內(nèi)可見淤膽；匯管區(qū)及肝細(xì)胞間見少量淋巴細(xì)胞浸潤 圖5 肝移植術(shù)后10個月第5次移植肝組織病理學(xué)特征及免疫組織學(xué)染色（HE染色，×400） 大部分肝細(xì)胞水腫，胞漿渾濁至空泡變性；膽管上皮細(xì)胞胞漿空泡變性；匯管區(qū)及肝細(xì)胞間見少量淋巴細(xì)胞浸潤；膽管壁、血管壁均見少量炎癥細(xì)胞浸潤 圖6 肝移植術(shù)后16個月第6次移植肝組織病理學(xué)特征及免疫組織學(xué)染色（HE染色，×400） 大部分肝細(xì)胞水腫，胞漿渾濁至空泡變性；匯管區(qū)有壞死，結(jié)構(gòu)欠清，可見個別管壁不完整膽小管；中央靜脈血管壁結(jié)構(gòu)破壞；匯管區(qū)及肝細(xì)胞間見少量淋巴細(xì)胞浸潤Fig.1 Histopathological features and immunohistological staining of initially transplanted liver at Day 24 after liver transplantation（HE，×400）Fig.2 Histopathological features and immunohistological staining of a second liver transplantation at Day 37 after liver transplantation（HE，×400） Fig.3 Histopathological features and immunohistological staining of the third transplanted liver at Day 47 after liver transplantation（HE，×400） Fig.4 Histopathological features and immunohistological staining of the fourth transplanted liver at Month 4 after liver transplantation（HE，×400） Fig.5 Histopathological features and immunohistological staining of the fifth transplanted liver at Month 10 after liver transplantation（HE，×400） Fig.6 Histopathological features and immunohistological staining of the6th transplanted liver at Month 16 after liver transplantation（HE，×400）

三、轉(zhuǎn)歸情況

患兒經(jīng)血漿置換治療后，繼續(xù)予口服他克莫司和潑尼松抑制免疫反應(yīng)，總膽紅素在30～100 μmol/L波動，持續(xù)近1個月后恢復(fù)正常，未出現(xiàn)明顯出血、嘔吐等異常表現(xiàn)。截至2021年12月已隨訪3年，復(fù)查過程中行移植肝穿刺活檢5次，發(fā)現(xiàn)排斥反應(yīng)逐步減輕，肝功能基本維持正常，未出現(xiàn)AMR復(fù)發(fā)。

討 論

器官移植術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生情況是影響移植物長期存活的一個重要因素。經(jīng)典免疫學(xué)理論認(rèn)為，移植術(shù)后T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)（T cell-mediated rejection，TCMR）是其主要致病原因，目前臨床應(yīng)用的免疫抑制劑也主要是針對T細(xì)胞活化、增殖、分化的環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，有效改善了大部分患兒的預(yù)后，但仍有部分患兒服用該類藥后仍出現(xiàn)移植物損傷，甚至是難以治療的損傷。隨著研究的深入，學(xué)者們逐漸認(rèn)識到抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)（antibody mediated rejection，MR）是造成該部分移植物損害的重要因素之一。肝臟具有特殊的固有免疫系統(tǒng)，過去一直認(rèn)為肝移植術(shù)后出現(xiàn)AMR的風(fēng)險(xiǎn)很低，但隨著肝移植的快速發(fā)展，肝移植術(shù)后發(fā)生AMR的概率也隨之增加，但尚未被充分認(rèn)識。

AMR作為肝移植術(shù)后并不常見的一類難治性嚴(yán)重并發(fā)癥，早期診斷是早期獲得治療的前提，也是獲得良好預(yù)后的關(guān)鍵。但AMR無明顯特征性臨床表現(xiàn)，也缺乏特異性指標(biāo)，使得早期診斷存在一定的難度。AMR在ABO血型不合的肝臟移植受者中相對常見，但在ABO血型相合的肝臟移植受者中也可發(fā)生，其發(fā)生與受者易感性密切相關(guān)，AMR的易感性取決于抗體效價(jià)、特異性、時(shí)間、類別、濃度及靶抗原分布等，也有研究表明低度易感性可導(dǎo)致AMR的發(fā)生［3-4］。

供體抗原特異性抗體（donor special antibody，DSA）被認(rèn)為是導(dǎo)致AMR發(fā)生、發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素。兒童肝移植術(shù)后出現(xiàn)DSA的概率較成人高，有研究報(bào)道兒童肝移植術(shù)后DSA陽性率高達(dá)54%［5］。DSA大部分出現(xiàn)在肝移植術(shù)后的早期，但術(shù)后早期（＜90 d）在出現(xiàn)肝功能衰竭的患者中僅占1%，而在DSA陽性患者中出現(xiàn)早期肝功能衰竭的比例則達(dá)到10%［6］。另一項(xiàng)對兒童肝移植術(shù)后10年的隨訪研究中發(fā)現(xiàn)，24例肝功能正常的受者中，DSA陽性率高達(dá)33%［7］。肝移植術(shù)后出現(xiàn)DSA的危險(xiǎn)因素很多，包括使用環(huán)孢素而非他克莫司、低免疫抑制水平、術(shù)前終末期肝病評分（model for endstage liver disease，MELD）＜15分、低年齡等，但使用環(huán)孢素是否為高危因素目前存在分歧［8］。寧禹等［9］報(bào)道了3例兒童親體肝移植術(shù)后成功撤除免疫抑制劑的病例，全部使用環(huán)孢素抑制免疫反應(yīng)被認(rèn)為是此3例患兒的共同特征之一，但缺乏病理學(xué)和免疫學(xué)指標(biāo)方面的證據(jù)支持。有研究人員認(rèn)為受者年齡偏?。ǎ?歲）和鈣調(diào)神經(jīng)酶抑制劑濃度過低（環(huán)孢素＜30 ng/mL或他克莫司＜3 ng/mL）與DSA的發(fā)生相關(guān)度很高［10］。也有研究發(fā)現(xiàn)HLA-Ⅱ類抗體錯配及之前發(fā)生過細(xì)胞排斥反應(yīng)是誘發(fā)DSA的危險(xiǎn)因素［11］。DSA與肝移植術(shù)后AMR的發(fā)生密切相關(guān)，但并非所有DSA都會誘發(fā)AMR，具體的發(fā)病機(jī)制尚不明確，有研究人員認(rèn)為重點(diǎn)需關(guān)注T細(xì)胞對B細(xì)胞增殖的關(guān)鍵輔助作用［12-13］。在兒童肝移植術(shù)后DSA導(dǎo)致的AMR中，還有一個顯著特征就是抗體位點(diǎn)集中于HLA-Ⅱ類抗體，主要是DQ、DR位點(diǎn)，且表達(dá)強(qiáng)度較高。國外研究發(fā)現(xiàn)，在27例兒童肝移植術(shù)后DSA陽性的受者中，DSA主要針對HLA-Ⅱ類抗原，所占比例HLA-DR為41%、HLA-DQ為53%，其中DQ DSA的比例在非耐受組患者高達(dá)61%，明顯高于穩(wěn)定組的20%和耐受組的29%。而在非耐受患者中，DQ DSA的平均熒光強(qiáng)度可達(dá)13 000以上［14-15］。也有研究人員認(rèn)為移植術(shù)前DSA平均熒光強(qiáng)度大于5 000即有臨床意義，且提示預(yù)后不良［16］。

本例患兒雖為ABO血型相合的親屬活體肝臟移植患者，但手術(shù)時(shí)年齡僅7個月，病程中因合并嚴(yán)重肺部感染，曾多次停用他克莫司抑制免疫反應(yīng)，當(dāng)出現(xiàn)肝功能異常時(shí)考慮到發(fā)生排斥反應(yīng)的可能，并及時(shí)完善了血液HLA和移植肝活檢等檢查。供體HLA血液檢測提示陽性，經(jīng)與供體HLA配型比對后發(fā)現(xiàn)存在DSA，且為HLA-DQ抗體，MFI為10705。第1次移植肝活檢提示：肝細(xì)胞明顯水腫，空泡變性，少數(shù)壞死；肝細(xì)胞胞漿可見淤膽；匯管區(qū)見混合性炎癥細(xì)胞浸潤；膽管壁炎癥細(xì)胞浸潤；血管壁血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，個別壞死，符合肝移植后中-重度急性排斥反應(yīng)。遺憾的是該患兒第1次病檢時(shí)未進(jìn)行C4d染色，但根據(jù)臨床表現(xiàn)和血清DSA陽性以及病檢情況，經(jīng)科室討論后還是重點(diǎn)考慮肝移植術(shù)后AMR。在隨后進(jìn)行的第2次移植肝活檢病理結(jié)果中，C4d在肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞可見弱陽性表達(dá)，證實(shí)了我們之前的判斷。參照目前診斷AMR的Baff國際會議標(biāo)準(zhǔn)，肝移植術(shù)后DSA介導(dǎo)AMR的診斷是明確的［2］。但應(yīng)注意的是在肝移植患者中，C4d作為一個嚴(yán)格反映AMR的標(biāo)志物仍存在爭議，肝活檢C4d染色陰性并不能完全排除急性AMR。本例患兒能在早期得到確診，在于本研究團(tuán)隊(duì)對肝移植術(shù)后可能發(fā)生AMR有警惕意識，當(dāng)患兒肝功能出現(xiàn)異常時(shí)，能意識到發(fā)生AMR的可能并及時(shí)完善血清DSA和移植肝活檢等檢查是我們早期正確診斷的關(guān)鍵。

肝移植術(shù)后急性AMR一旦診斷明確后應(yīng)及時(shí)治療，盡量避免二次肝移植。目前國際上尚無肝移植術(shù)后AMR的標(biāo)準(zhǔn)治療方案［17］。治療的原則主要是降低DSA活性、減少DSA產(chǎn)生，減輕排斥反應(yīng)的發(fā)生。常用的方式包括有：①清除體內(nèi)各種抗體，如血漿置換或免疫吸附等；②抑制B淋巴細(xì)胞分化，如利妥昔單抗、他克莫司以及硼替佐米等；③應(yīng)用免疫抑制劑，如IVIG和激素沖擊療法等。血漿置換能有效清除外周血中的DSA，改善肝功能，特別是對于伴有高膽紅素血癥的肝功能異常患者，可發(fā)揮較好的療效；而IVIG可中和抗體、抑制補(bǔ)體、競爭性抑制自身IgG、抑制某些涉及免疫反應(yīng)的細(xì)胞、阻斷γ-干擾素（γ-interferon，IFN-γ）信號、擴(kuò)增調(diào)節(jié)性細(xì)胞等。血漿置換和IVIG是目前急性AMR治療最常用的一種聯(lián)合治療方案。嗎替麥考酚酸酯是一種干擾細(xì)胞代謝的免疫抑制劑，可同時(shí)抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞的增殖以及T細(xì)胞間單磷酸鳥苷（guanosine monophosphate，GMP）的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而起到抑制AMR的作用。利妥昔單抗可通過清除記憶性B細(xì)胞、減少漿細(xì)胞的生成，進(jìn)而減少DSA的產(chǎn)生，適用于治療頑固性AMR。硼替唑米是一種蛋白酶抑制劑，其作用機(jī)制是減少DSA的生成，從而控制AMR的發(fā)生。鞏穎等［18］采用血漿置換治療肝移植術(shù)后急性AMR，亦獲得良好的治療效果。王凱等［19］研究發(fā)現(xiàn)交替予以血漿置換和IVIG等治療兒童ABO血型不合肝移植術(shù)后AMR，可有效清除體內(nèi)DSA，減弱DSA的作用，阻止排斥反應(yīng)進(jìn)展，隨后再應(yīng)用清除B細(xì)胞藥物，可徹底消除DSA、治愈AMR。

本例患兒在診斷AMR明確后，我們立即予以甲潑尼龍靜脈沖擊＋靜脈丙種球蛋白＋嗎替麥考酚脂口服治療，當(dāng)效果不理想時(shí)，及時(shí)予血漿置換治療，在使用血漿置換過程中，患兒肝功能逐步改善，除血小板和血紅蛋白輕度下降外，無其他不良反應(yīng)發(fā)生，后續(xù)逐步調(diào)整免疫抑制劑的劑量，患兒病情得到好轉(zhuǎn)，未使用利妥昔單抗和硼替唑米。

總之，AMR是兒童肝移植術(shù)后一種少見的并發(fā)癥，其后果嚴(yán)重，預(yù)后較差，且缺乏特征性臨床表現(xiàn)，因此提高對肝移植術(shù)后發(fā)生AMR的重視程度，對于預(yù)防AMR的發(fā)生尤為重要。密切監(jiān)測病情、維持免疫抑制劑的正常濃度，是預(yù)防AMR發(fā)生的有效方法。術(shù)前檢測DSA，術(shù)后定期監(jiān)測其濃度，有利于判斷肝移植受者的狀態(tài)，及時(shí)完善移植肝活檢，有利于早期明確診斷。AMR一經(jīng)診斷，應(yīng)積極給予血漿置換和IVIG輸入等聯(lián)合治療方案，可避免移植物功能喪失，使其恢復(fù)正常功能。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明文獻(xiàn)檢索為袁遠(yuǎn)宏、張慧，論文調(diào)查設(shè)計(jì)為袁遠(yuǎn)宏、肖政輝、張慧，數(shù)據(jù)收集與分析袁遠(yuǎn)宏、尹強(qiáng)、陳衛(wèi)堅(jiān)、賀杰、張慧，論文結(jié)果撰寫為袁遠(yuǎn)宏、張新萍、盧秀蘭，論文討論分析為袁遠(yuǎn)宏、肖政輝、張慧、盧秀蘭