王一涵，石文軍，李奇兵，胡玉珍，趙玉輝，王廣文，嚴 婭，姜 麗，陳化蘭，李呈軍

（中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室/農業(yè)農村部動物流感重點開放實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069）

流感是重要的人獸共患病之一，其病原流感病毒可以在人群中迅速傳播，從而引起全球范圍內的廣泛流行[1]。流感病毒不斷進化變異，持續(xù)產(chǎn)生威脅動物和人類健康的新病毒株。鑒于流感病毒對養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和公共衛(wèi)生安全的嚴重危害，加強流感病毒研究仍是動物疫病防控和保障人類健康的重中之重。流感病毒的復制過程是病毒與宿主因子相互作用的博弈過程，在這個過程中宿主因子對流感病毒感染、致病、傳播等生物學特性發(fā)揮重要作用[2]。

流感病毒復制高度依賴于宿主細胞。病毒與其宿主之間多方面相互作用決定了感染的結果，包括子代病毒的增殖和致病性。宿主因子可以直接作為與病毒蛋白相互作用的內在限制因子，也可以通過誘導或調節(jié)抗病毒細胞因子而間接發(fā)揮作用。同時，一些宿主因子也可以通過不同的分子機制來抑制病毒的侵入、脫衣殼、核酸復制或病毒的釋放過程，最終導致病毒感染率和發(fā)病率的降低。目前已有很多關于宿主蛋白抗病毒功能的研究，例如，TRIM5α 通過與病毒衣殼結合并誘導病毒過早脫衣殼而被廣泛用于抑制物種特異性逆轉錄病毒復制[3]；TRIM33 通過降低HIV-1 整合酶功能抑制HIV-1 cDNA整合入宿主細胞基因組[4]；PLSCR1 與流感病毒NP 蛋白相互作用，抑制NP 蛋白入核，從而抑制流感病毒復制[5]。角蛋白（Keratin，KRT）可以保護上皮組織細胞免受損傷或壓力[6]。Ⅱ型細胞角蛋白由堿性或中性蛋白組成，在上皮組織分化過程中共同表達，參與角蛋白細胞激活、增殖和角蛋白化[7]。宿主因子Ⅱ型角蛋白2（KRT2）是人類染色體12號上的基因，該基因編碼的蛋白隸屬于纖維結構蛋白家族之一的角蛋白家族。本研究前期通過質譜鑒定的方法篩選到KRT2，其可能與流感病毒復制相關。

本研究通過瞬時轉染pCAGGS-KRT2-Myc 質粒過表達以及針對KRT2 基因的特異性siRNA 干擾技術改變KRT2 蛋白的表達水平，檢測KTR2 蛋白對流感病毒復制的影響，以期揭示KRT2 對流感病毒復制周期的調控作用。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 HEK293T 細胞和A/WSN/1933（H1N1）株流感病毒為本實驗室保存；A549 細胞購自ATCC。pCAGGS-KRT2-Myc 真核表達質粒由本實驗室構建；質粒提取試劑盒購于Qiagen 公司；總RNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；HiScript Q RT SuperMix for qPCR、ChamQ SYBR qPCR Master Mix 購自南京諾唯贊生物科技有限公司；轉染試劑Lipofectamine 2000 和Lipofectamine RNAi MAX Transfection Reagent 購自Thermo Scientific 公司；siR?NA由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay 購 自Promega 公 司；Primestar DNA 聚合酶購自TaKaRa 公司；限制性內切酶和快速連接酶購自NEB 公司；Protein Marker 購自上海雅酶生物科技有限公司；5×蛋白上樣緩沖液購自上海碧云天生物科技有限公司；兔抗Myc 多克隆抗體購自金斯瑞生物科技有限公司；兔抗NP多克隆抗體為本實驗室制備；兔抗GAPDH多克隆抗體購自Santa Cruz公司；山羊抗兔IgG-Cy5、山羊抗鼠IgG-FITC及鼠抗NP單克隆抗體均購自Li-COR Bioscience公司。

1.2 過表達KRT2 蛋白對流感病毒復制影響的檢測

1.2.1 KRT2 蛋白過表達的檢測 將1 μg pCAGGSKRT2-Myc 表達質粒和1 μg pCAGGS 空載體質粒按照Lipofectamine 2000 轉染試劑說明書分別轉染HEK293T細胞。轉染24 h后，用MOI 0.01的A/WSN/1933（H1N1）株病毒感染細胞，感染48 h 后加入100 μL 裂解液裂解細胞，經(jīng)95 ℃處理后，以兔抗Myc 標簽抗體（1∶300）為一抗，兔抗GAPDH 多克隆抗體（1∶1 000）作為內參，以山羊抗兔IgG-Cy5（1∶500）為二抗，經(jīng)western blot 檢測KTR2 蛋白過表達情況。

1.2.2 噬斑滴定檢測過表達KRT2 蛋白對流感病毒復制的影響 將HEK293T 細胞傳代于賴氨酸包被的12 孔細胞培養(yǎng)板中，待其生長至80%融合度后，利用Lipofectamine 2000 轉染試劑將pCAGGS-KRT2-Myc（1 μg）表達質粒轉染至HEK293T 細胞中，對照組細胞則轉染1 μg pCAGGS 空載體質粒。轉染24 h 后，利用MOI 0.01 的A/WSN/1933（H1N1）株病毒感染細胞，分別于感染后24 h、48 h 收集細胞上清，參照文獻[8]進行噬斑滴定，檢測上調表達KRT2 蛋白對流感病毒復制的影響。

1.3 激光共聚焦檢測過表達KRT2 蛋白對流感病毒復制的影響 參照1.2.2 中方法轉染pCAGGS-KRT2-Myc 于A549 細 胞24 h 后，以MOI 5 的A/WSN/1933（H1N1）株病毒感染，于感染后0、4 h、6 h 分別收集細胞，用4%多聚甲醛固定細胞，0.1% Triton X-100通透處理20 min，5%脫脂乳封閉1 h 后，以鼠抗NP單克隆抗體（1∶500）和兔抗Myc 標簽抗體（1∶300）為一抗，山羊抗鼠IgG-FITC（1∶500）和山羊抗兔IgGCy5（1∶500）為二抗，通過激光共聚焦顯微鏡觀察KRT2 蛋白對病毒NP 蛋白表達的影響。

1.4 siRNA干擾下調KRT2蛋白表達后細胞活力的檢測及siRNA 篩選 根據(jù)NCBI 中的KRT2 基因，設計合成兩對針對KRT2 基因的特異性siRNA 和對照NC siRNA，siRNA-1序列為：正鏈（5'-3'）：GCAGCCUCU CAACGUGAAATT/反鏈（5'-3'）：UUUCACGUUGAGAG GCUGCTT；siRNA-2 序列為：正鏈（5'-3'）：GCUGCU ACAACAAAUGAAUTT/反鏈（5'-3'）：AUUCAUUUGUU GUAGCAGCTT；NC siRNA 序列為：正鏈（5'-3'）：UU CUCCGAACGUGUCACGUTT/反鏈（5'-3'）：ACGUGAC ACGUUCGGAGAATT。利用Lipofectamine RNAiMAX試劑將20 pmol（1 μL）對照NC siRNA和兩對KRT2特異性siRNA分別轉染A549細胞，置于37 ℃培養(yǎng)48 h后，利用細胞活力檢測試劑盒CellTiter-Glo kit 檢測干擾下調KRT2表達是否影響細胞活力。同時收集轉染48 h后細胞樣品，采用文獻[9]中熒光定量PCR 方法檢測KRT2 mRNA 轉錄水平，篩選干擾效率最佳的siRNA。

1.5 siRNA 干擾下調KRT2 蛋白表達后對流感病毒復制影響的檢測

1.5.1 噬斑滴定檢測siRNA 干擾下調KRT2 蛋白表達后對流感病毒復制的影響 利用Lipofectamine RNAi MAX Transfection Reagent 將20 pmol（1 μL）對照NC siRNA 和篩選的最佳siRNA 分別轉染生長至80%融合度的A549 細胞，48 h 后利用MOI 0.01 的A/WSN/1933（H1N1）株病毒感染細胞，分別于感染后24 h、48 h 收集細胞上清進行噬斑滴定[8]，檢測下調KRT2蛋白表達對流感病毒復制的影響。同時，在倒置熒光顯微鏡下觀察感染48 h 后對照組和干擾組A549 細胞的病變情況，進一步分析下調KRT2 蛋白表達對流感病毒復制的影響。

1.5.2 siRNA 干擾下調KRT2 蛋白表達影響流感病毒蛋白表達水平的檢測 將20 pmol（1 μL）對照NC siRNA和最佳KRT2 特異性siRNA 分別轉染A549 細胞。48 h后用MOI 5 的A/WSN/1933（H1N1）株病毒感染細胞，分別在感染后0、4 h、6 h、8 h 在每孔中加入300 μL IP 裂解液，冰上裂解1 h，收集裂解的細胞，4 ℃離心10 min 取上清，95 ℃處理后，以兔抗NP 多克隆抗體（1∶500）為一抗，兔抗GAPDH 多克隆抗體（1∶1 000）作為內參，DyLight680羊抗兔IgG（1∶10 000）為二抗，經(jīng)western blot 檢測siRNA 干擾KTR2 蛋白對流感病毒NP 蛋白表達的影響。

1.6 激光共聚焦檢測KRT2 蛋白對流感病毒復制早期階段的影響 按1.5.1 轉染siRNA 后以MOI 5 的A/WSN/1933（H1N1）病毒感染A549 細胞后4 h、6 h、8 h 收集細胞，按照1.3 方法，通過激光共聚焦試驗觀察KRT2 蛋白對病毒NP 蛋白入核的影響。

1.7 試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析 采用GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計學處理，以t檢驗比較組間差異。ns表示P＞0.05，差異不顯著；* 表示P＜0.05，差異顯著；**表示P＜0.01，差異極顯著。

2 結 果

2.1 過表達KRT2蛋白對流感病毒復制影響的檢測結果 將pCAGGS-KRT2-Myc真核表達質粒轉染至HEK 293T細胞中，western blot 檢測結果顯示，轉染細胞中KTR2蛋白表達水平明顯提高（圖1A）。用MOI 0.01的A/WSN/1933（H1N1）株病毒感染轉染24 h 后的HEK293T細胞，分別于感染后24 h、48 h收集細胞上清進行噬斑滴定，結果顯示，在病毒感染后的24 h、48 h，過表達KRT2蛋白的實驗組相比于轉染pCAGGS空載體的對照組，流感病毒的滴度均極顯著下降（P＜0.01）（圖1B）。上述結果表明過表達KRT2可以抑制流感病毒復制。

圖1 過表達KRT2 蛋白western blot（A）和病毒噬斑滴定（B）檢測結果Fig.1 Western blot of KRT2 protein expression(A)and virus titer detection by plaque assay(B)in MDCK cells

2.2 激光共聚焦檢測過表達KRT2蛋白對流感病毒復制影響的結果 進一步利用激光共聚焦顯微鏡觀察感染后0、4 h、6 h的過表達KRT2蛋白的細胞，結果顯示，KRT2蛋白過表達后，在4 h時流感病毒NP蛋白向細胞核內的聚積受到了抑制（圖2），初步表明KRT2蛋白可能在流感病毒復制早期發(fā)揮抑制作用。

圖2 激光共聚焦分析KRT2 蛋白過表達對流感病毒復制的影響Fig.2 Effect of KRT2 overexpression on influenza virus replication was analyzed by CLSM

2.3 siRNA 下調KRT2 蛋白表達后細胞活力的檢測及siRNA 篩選 利用Lipofectamine RNAi MAX Trans?fection Reagent 將兩條特異性siRNA 和對照NC siRNA分別轉染A549 細胞，進行細胞活力檢測，結果顯示，轉染組細胞活力與對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）（圖3A）。

利用Lipofectamine RNAi MAX Transfection Reagent將特異性siRNA-1/2 和對照NC siRNA 分別轉染A549細胞后，利用熒光定量PCR 的方法分別檢測兩條KRT2 siRNA 的干擾效率。結果顯示，與對照組比較，兩條KRT2 siRNA 均可以極顯著下調A549 細胞內KRT2蛋白的表達（P＜0.01），其中siRNA-2下調效率最高（圖3B）。因此本實驗選擇siRNA-2進行后續(xù)試驗。

圖3 細胞活力（A）及siRNA干擾效率（B）檢測Fig.3 Detection results of siRNA-treated A549 Cell viability(A)and siRNA interference efficiency(B)

2.4 siRNA 干擾下調KRT2 蛋白表達后對流感病毒復制影響的檢測結果 以MOI 0.01 的A/WSN/1933（H1N1）株病毒感染siRNA 干擾后的細胞，收集細胞上清，進行噬斑滴定，結果顯示，相比于對照組，干擾組流感病毒的滴度在感染后不同時間均顯著升高（P＜0.01）（圖4A）。為了進一步驗證該結論，檢測A/WSN/1933（H1N1）株病毒感染后0、4 h、6 h、8 h NP蛋白的表達情況，結果顯示，KRT2蛋白表達下調后流感病毒NP蛋白的表達水平在感染后各時間點均高于對照組（圖4B）。A/WSN/1933（H1N1）株病毒感染48 h后鏡下觀察細胞病變情況，發(fā)現(xiàn)相比對照組細胞，干擾組的細胞病變更明顯（圖4C）。綜上所述，表明下調KRT2蛋白表達可提高流感病毒的復制水平。

圖4 siRNA下調KRT2蛋白表達后對流感病毒復制影響的檢測結果Fig.4 The results of the replication of influenza virus by down-regulating KRT2 protein

2.5 激光共聚焦檢測下調KRT2 蛋白表達對流感病毒復制影響的結果 于流感病毒感染siRNA-2 干擾組和對照組A549 細胞后各時間點，收獲樣品進行激光共聚焦檢測，結果顯示轉染KRT2 siRNA-2 的A549細胞在感染病毒4 h 后，NP 蛋白在細胞核內聚積的比例相比轉染對照NC siRNA 的A549 細胞明顯升高；感染6 h 后，對照細胞內新合成的NP 蛋白主要聚集在細胞核周圍，而在干擾組的A549 細胞中新合成的NP 蛋白則明顯聚積于細胞核內；在感染8 h后，對照細胞內的NP 蛋白在細胞核和細胞質均有分布，而在干擾組A549 細胞中NP 蛋白已經(jīng)被完全輸出細胞核并在細胞質膜聚積，表明子代核糖核蛋白復合體（vRNP）已經(jīng)運輸?shù)郊毎|膜包裝位點（圖5）。上述數(shù)據(jù)進一步表明，KRT2 蛋白抑制流感病毒復制的早期階段，從而導致病毒整個復制周期的延遲。

圖5 激光共聚焦檢測KRT2蛋白對流感病毒復制早期階段影響的結果Fig.5 The effect of KRT2 protein on the early stage of influenza virus replication by CLSM

3 討 論

本實驗采用噬斑滴定、western blot、激光共聚焦技術研究了宿主因子KRT2 對A 型流感病毒復制的影響，結果顯示，過表達KRT2 蛋白可以下調流感病毒的復制。相反，干擾KRT2 蛋白的表達后可以上調流感病毒的復制。此外，通過激光共聚焦實驗證明KRT2蛋白最有可能參與了流感病毒復制的早期階段。

在流感病毒復制的早期階段，病毒識別和結合宿主細胞表面的唾液酸受體，通過受體介導的內吞作用進入細胞，流感病毒可通過網(wǎng)格蛋白介導的以及網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白非依賴的內吞途徑感染細胞[10]。細胞內吞包括吞噬作用和胞飲作用[11]。吞噬作用通常是指特定細胞消化大顆粒和細菌，如巨噬細胞；胞飲作用是指負責細胞對液體、大分子和病毒等小病原體的吸收[12]。胞飲作用涉及幾個不同的機制：巨胞飲、網(wǎng)格蛋白介導的內吞作用、小窩蛋白介導的內吞作用，以及不依賴網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白的通路。網(wǎng)格蛋白介導的內吞作用是依賴受體和結合配體的濃度進入網(wǎng)格蛋白包裹的囊泡發(fā)生的[8]。在內吞體的酸性環(huán)境中病毒囊膜與內吞體膜融合，而后經(jīng)過脫殼過程，病毒vRNP 復合體與基質蛋白M1解離后釋放到細胞質中，最終經(jīng)過經(jīng)典的細胞核輸入途徑進入細胞核[13]。本研究發(fā)現(xiàn)KRT2 可能影響流感病毒復制的早期階段，但是KRT2 蛋白影響流感病毒復制早期階段中的具體環(huán)節(jié)仍有待深入研究。由于目前針對KRT2 家族蛋白與病毒復制之間的研究仍然很少，因此，本研究下一步針對宿主因子KRT2 與流感病毒復制的早期階段之間的關系進行研究，以期發(fā)現(xiàn)宿主因子KRT2 調控流感病毒復制的分子機制，深化對宿主因子影響流感病毒復制機制的認知。