陳 姍，馬浩原，付兢鋒，李 強，李香子，高 旭

（延邊大學農(nóng)學院動物醫(yī)學系，吉林 延吉 133000）

牛病毒性腹瀉/粘膜病（Bovine viral diarrhea-mu?cosal disease，BVD-MD）是由BVD 病毒（BVDV）引起的一種牛及其他反芻動物出現(xiàn)呼吸道疾病、腹瀉、胎兒先天畸形和生殖障礙的傳染病[1-2]，呈全世界范圍分布。BVDV 可穿過妊娠前3 個月的母牛胎盤，致使其所生犢牛永久性感染，并生長發(fā)育為持續(xù)感染（PI）犢牛，終生持續(xù)排出大量病毒，導致病毒無法凈化而使疫情蔓延，嚴重制約了養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展，給牛產(chǎn)業(yè)造成重大經(jīng)濟損失[3]。BVDV 屬黃病毒科，瘟病毒屬，單股正鏈RNA 病毒，基因組全長約12.3 kb，其包括5'端非翻譯區(qū)（5'UTR）、一個編碼區(qū)開放閱讀框（ORF）和3'端非翻譯區(qū)（3'UTR），其中5'UTR 高度保守，常用于分離病毒的基因型鑒定[4]。根據(jù)5'UTR等基因可將BVDV 分為3 種基因型，即BVDV-1 型、BVDV-2 型和BVDV-3 型，其中BVDV-1 型又分為21個亞基因型（1a-1u），我國以BVDV-1b 和BVDV-1m兩個亞型流行為主[5]。

吉林省延邊朝鮮族自治州是中國5 大地方良種牛之一—延邊黃牛的產(chǎn)地，與俄羅斯和北朝鮮毗鄰，擁有廣闊的草原牧場，但由于存在地處三國交界的復雜地理因素，加之放牧飼養(yǎng)的不可控因素，近年來使延邊黃牛嚴重腹瀉病例多點發(fā)生并呈現(xiàn)蔓延趨勢，嚴重制約了延邊黃牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。另外延邊朝鮮族自治州有11 個對朝、對俄口岸，口岸過貨量占吉林省的90%以上，近年來畜產(chǎn)品進出口貿(mào)易也逐漸增多，因此對該地區(qū)動物傳染病調(diào)查分析十分必要。2021 年3 月吉林省延邊朝鮮族自治州琿春市某牛場的犢牛出現(xiàn)了嚴重腹瀉，此前該地區(qū)未見關(guān)于BVDV 感染的報道。因此，本研究采集延邊地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)牛場患病犢牛的糞便樣品，經(jīng)分離鑒定后為BVDV 感染，并進一步對分離株進行了遺傳進化分析和電鏡觀察，為延邊地區(qū)BVD 疫情的防控和疫苗研制提供物質(zhì)基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 犢牛糞便樣品采集自吉林省延邊朝鮮族自治州規(guī)?；B(yǎng)牛場疑似BVDV 感染犢牛。MDBK細胞由延邊大學預防獸醫(yī)實驗室保存。MEM細胞培養(yǎng)液和胎牛血清購自GIBCO 公司；DL1000 DNA Marker、PrimeScript RT reagent kit、pMD18-T 載體 購自TaKaRa 公司；質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒以及100 ku 中空纖維柱購自O(shè)mega 公司。

1.2 引物設(shè)計 參考GenBank中登錄的BVDV-5'UTR基因序列（GQ985457），設(shè)計一對特異引物BVDV-F：5'-ATGCCCWTAGTAGGACTAGCA-3'/BVDV-R：5'-TCAACTCCATGTGCCATGTAC-3'，預期擴增的目的基因為288 bp，引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.3 細胞培養(yǎng)與病毒分離 將糞便樣品按照常規(guī)方法處理后接種細胞豐度達到80%以上的MDBK 細胞，孵育1 h 后加入含有10% FBS 的MEM 細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后收獲細胞培養(yǎng)物，經(jīng)反復凍融3次后繼續(xù)傳代5 代，觀察細胞病變（CPE），同時設(shè)置MDBK 細胞作為空白對照。采用TRIzol 抽提方法提取盲傳至第5 代細胞培養(yǎng)物RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后作為模板，以BVDV-F/R 為引物進行PCR 鑒定，退火溫度為56 ℃。

1.4 5'UTR 基因的PCR 擴增及遺傳進化分析 將1.3 中PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收純化產(chǎn)物TA 克隆，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞后利用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，按照1.3 中PCR 方法鑒定為陽性的質(zhì)粒送由長春庫美生物公司測序。參照GenBank 中相關(guān)序列，利用DNAStar 軟件對BVDV 5'UTR 測序結(jié)果比對和遺傳進化分析。

1.5 病毒電鏡觀察 對RT-PCR 鑒定為BVDV 陽性的細胞培養(yǎng)物繼續(xù)傳2 代，即傳至第7 代時取5 mL培養(yǎng)液經(jīng)8 000 r/min 離心10 min 后，反復凍融3 次，上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后以100 ku 中空纖維柱對病毒液濃縮后，戊二醛固定1 h，再用2%磷鎢酸負染，利用透射電鏡觀察病毒粒子大小及形態(tài)。

2 結(jié)果與討論

2.1 病毒的分離與鑒定 糞便樣品提取物接種于MDBK 細胞后觀察可見，盲傳第5代的細胞培養(yǎng)24 h～72 h 未出現(xiàn)BVDV 典型的空泡病變（圖1B），陰性對照細胞生長狀態(tài)良好（圖1A）；RT-PCR 鑒定結(jié)果顯示，在約300 bp 處出現(xiàn)一目的條帶，與預期大小相符（圖1C）。初步表明分離病毒為非細胞病變型（NCP型）BVDV。根據(jù)生物型可將BVDV 分為細胞病變型（CP）和NCP 型，CP 型BVDV 感染主要造成消化道損傷，且相對罕見[6]，而NCP 型BVDV 對白細胞、淋巴器官和呼吸道均有嗜性，胎兒在宮內(nèi)感染NCP 型BVDV 后，除了會引起呼吸道、胃腸道、生殖系統(tǒng)等黏膜病外，還可導致幼畜免疫耐受和持續(xù)性感染（PI），這些PI 動物出生后持續(xù)釋放病毒，形成病毒向易感動物傳播的主要途徑，這也是BVDV 難以凈化的主要原因[7]。結(jié)合糞便樣品來源的犢牛臨診癥狀和病理變化，初步判定本研究的BVDV 分離株其為NCP 型。

圖1 病毒的分離與鑒定結(jié)果（200×）Fig.1 Isolation and identification results of BVDV(200×)

2.2 病毒遺傳進化分析結(jié)果 進一步對PCR 擴增的5'UTR 測序后比對分析，結(jié)果顯示其為288 bp（5'UTR OM622422），與GenBank 中 已 登 錄BVDV 5'UTR 基因的同源性為73.1%～99.7%，進一步表明分離株為BVDV；遺傳進化樹分析結(jié)果顯示，該分離病毒株與BVDV-2、BVDV-3、CSFV、粘膜病病毒（BDV）不在同一分支，親緣性較遠，與BVDV-1 在同一分支，且同源性達98.9%（圖2A），表明其屬于BVDV-1 型。將分離的BVDV-1 與GenBank 中已登錄的18 個BVDV-1 亞型進行同源性分析，結(jié)果顯示，分離的BVDV-1 與南京株BVDV-1b（MK-059454）、阿根廷株BVDV-1b（MK684385）處于同一分支，表明本研究分離的BVDV 屬于1b 亞型（圖2B）。將其命名為YBHC 株BVDV-1b。

圖2 BVDV遺傳進化分析Fig.2 Genetic evolution analysis of BVDV

根據(jù)基因型和抗原差異將BVDV 分為BVDV-1 和BVDV-2 兩種基因型，其中BVDV-1 之間毒力變異較小，目前已知分離到21 個基因亞型（1a～1u）[8]。我國主要流行BVDV-1b 和BVDV-1m 基因亞型[9-10]。近些年，在歐洲還分離到一種新的BVDV 基因型，即BVDV-3 型，該基因型可分為Thai 源和Brazilian 源兩種基因亞型[11-12]。本研究BVDV 分離株經(jīng)鑒定屬于BVDV-1b 亞型，與以往我國流行的常見基因亞型相符，進一步驗證國內(nèi)BVDV 流行株基因型較為穩(wěn)定。

2.3 電鏡鑒定 收集盲傳7 代后的細胞培養(yǎng)物濃縮處理后于透射電鏡下觀察，可見YBHC 株BVDV-1b呈球形的病毒粒子，直徑大小為40 nm～60 nm，特征與已報道的BVDV 形態(tài)一致（圖3）[13]。病毒粒子是成熟的或結(jié)構(gòu)完整、有感染性的病毒個體，本研究YBHC 株BVDV-1b 病毒粒子的獲得為其生物學特性等進一步研究，以及疫苗的開發(fā)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖3 BVDV病毒粒子電鏡觀察（Bar=200 nm）Fig.3 Morphological observation of BVDV under electron microscope(Bar=200 nm)

延邊朝鮮族自治州地理位置特殊，地方品種延邊黃牛飼養(yǎng)量大，近年來其疫病暴發(fā)呈地域性、多變性和難控性等特點，黃牛嚴重腹瀉病例多點發(fā)生并呈現(xiàn)蔓延趨勢，嚴重制約了延邊黃牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究首次在延邊地區(qū)分離到BVDV，并鑒定為BVDV-1b 亞型，這為延邊地區(qū)BVDV 疫苗的研制及疫情防控提供了地方種毒和參考依據(jù)。