王旭貞，程 宇，譚仕明，馬海利*，梁立濱*

（1.山西省畜牧獸醫(yī)學(xué)校，山西 太原 030024；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801）

禽傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis，IB）是由IB 病毒（IBV）引起的一種雞急性、高度傳染性疾病。IB 臨床表現(xiàn)為產(chǎn)蛋率及產(chǎn)蛋品質(zhì)下降、上呼吸道癥狀、腎炎等，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的危害較大。該病最早于1931 年在美國(guó)北達(dá)科他州發(fā)現(xiàn)[1]，1972 年我國(guó)廣東地區(qū)首次報(bào)道該病，目前該病在全世界廣泛流行[2-3]。

IBV為冠狀病毒科γ-冠狀病毒屬單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約27.6 kb，基因組3'端編碼的結(jié)構(gòu)蛋白包括刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）及核衣殼蛋白（N）；編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白包括3a、3b、5a 和5b 蛋白。其中刺突S 蛋白全長(zhǎng)1 145 個(gè)氨基酸，在感染的宿主細(xì)胞內(nèi)可以被切割成S1 和S2 兩個(gè)亞基， S1 蛋白含有病毒特異性中和表位，是病毒的主要免疫原性蛋白，目前研究表明在全病毒基因組中S1 基因的變異率最高，發(fā)生在S1 基因的突變及重組事件對(duì)于IBV 新的基因型、血清型及突變株的出現(xiàn)起決定性作用[4-5]。目前，基于全長(zhǎng)S1 基因的進(jìn)化分析，IBV 可以分為7 個(gè)不同基因型，36 個(gè)分支，包括GI-1～GI-29、GII-1、GII-2 及GIII-1～GVII-1[6-8]。IB 的防控主要依賴于疫苗的應(yīng)用（包括減毒苗及滅活苗），但由于IBV 極易發(fā)生變異及重組產(chǎn)生抗原變異株，從而常引起疫苗免疫失敗。

2021 年5 月山西省晉中市某肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)22 日齡肉雞突然大量發(fā)病，肉雞采食量降低、咳嗽、甩頭、弓背扎堆并排白色水樣稀糞，發(fā)生疑似雞IB 疫情，本研究采集發(fā)病雞氣管、肺臟及腎臟等病料樣品接種SPF 雞胚進(jìn)行病毒的分離與鑒定，并對(duì)其S1基因序列進(jìn)行測(cè)序與分析，以期為本地區(qū)IBV 疫苗選擇及IB 疫情防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 疑似感染IBV 雞的氣管、肺臟、腎臟等臟器樣品采集自山西省晉中市某肉雞場(chǎng)。SPF 雞胚購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)（北京）有限公司。病毒RNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；ReverTra Ace?qPCR RT Kit 購(gòu)自東洋紡（上海）生物科技有限公司；2×RapidTaqMaster Mix 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；核酸純化及膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen 公司；DL 2000 DNA Marker 購(gòu)自TaKaRa 有限公司。

1.2 病雞剖檢觀察與病毒分離 將發(fā)病雞及死亡雞剖檢，觀察各器官病變情況。將采集的發(fā)病雞氣管、肺臟及腎臟加入無(wú)菌PBS 研磨，將研磨液4 ℃，8 000 r/min 離心10 min 后的上清用0.22 μm 濾器過(guò)濾除菌，以0.2 mL/枚接種SPF 雞胚尿囊腔，每個(gè)臟器研磨液接種3 枚SPF 胚。接種后的雞胚于37 ℃孵育，棄去24 h 內(nèi)死亡的雞胚，無(wú)菌收取72 h 死亡雞胚的尿囊液進(jìn)行后續(xù)鑒定。

1.3 禽呼吸道病毒RT-PCR 鑒定及血凝試驗(yàn) 利用病毒RNA 提取試劑盒提取1.2 中尿囊液RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA 并作為模板，采用文獻(xiàn)[9]中RT-PCR 方法鑒定幾種常見禽呼吸道病毒，包括禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）及IBV。同時(shí)將收集的尿囊液在SPF 雞胚上傳代。以常規(guī)方法制備1% 的SPF雞外周血紅細(xì)胞，將收集的雞胚尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)（HA），檢測(cè)尿囊液中是否含有可以凝集雞紅細(xì)胞的病原微生物。

1.4 分離病毒S1 基因的PCR 擴(kuò)增及序列分析 以1.3 中IBV 鑒 定 陽(yáng) 性 尿 囊 液 制 備 的cDNA 為 模 板，參考文獻(xiàn)[10]中并優(yōu)化PCR 方法擴(kuò)增S1 基因，回收擴(kuò)增片段由上海生工工程技術(shù)服務(wù)生物有限公司測(cè)序。自GenBank 中選取不同基因型IBV 70 株參考毒株，包括GI-1 至GI-29 基因型、GII-1、GIII-1、GIV-1、GV-1 及GVI-1 等基因型，及目前應(yīng)用的H120、4/91、M41、H52、LDT-3A等疫苗株，首先利用MAFFT 程序進(jìn)行多重序列比對(duì)，進(jìn)而利用Mega-X軟件Maximun Likelihood 方法中的Tamura-Nei model 進(jìn)行遺傳演化分析；將分離株S1 基因序列與常用疫苗株S1 基因序列利用DNAStar 軟件中MegAlign 程序進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)及同源性分析；將全長(zhǎng)S1 基因利用RDP4 軟件進(jìn)行重組分析，檢測(cè)S1 基因是否存在重組。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)病商品肉雞剖檢變化 在此次疑似暴發(fā)IB 疫情的肉雞場(chǎng)，隨機(jī)剖檢不同飼養(yǎng)區(qū)的10 只雞（5 只病死雞、5 只發(fā)病雞），發(fā)現(xiàn)主要組織病變損傷位于氣管和腎臟，可見氣管、支氣管內(nèi)有卡他性分泌物，并且氣管黏膜充血，腎臟腫大且小葉突出，符合近年流行的腎型IB 臨床病理特征。

感染的IBV 病毒株不同，侵害的器官不同，包括侵害呼吸道（引起咳嗽、氣管啰音等）、消化道（引起腺胃病變）、泌尿生殖道（引起腎臟腫大、產(chǎn)蛋率下降）等，從而引起不同的臨床癥狀[9-10]。其中腎型IB可以引起雞咳嗽、腎臟尿酸鹽沉積（“花斑腎”）、產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋下降，近年來(lái)流行較廣。

2.2 禽呼吸道相關(guān)病毒RT-PCR 鑒定及血凝試驗(yàn)為了快速鑒定本次疫情的病原，將采集的氣管、肺臟、腎臟組織樣品接種雞胚后提取尿囊液RNA，利用RT-PCR 方法鑒定結(jié)果顯示，除檢測(cè)到IBV N 基因目的條帶（386 bp）外，AIV 及NDV 擴(kuò)增結(jié)果均為陰性（圖1）；進(jìn)一步將上述尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)，結(jié)果顯示所收集的尿囊液均不能凝集紅細(xì)胞，進(jìn)一步排除了NDV、AIV等具有凝血活性的病原。

圖1 禽呼吸道疾病相關(guān)病原RT-PCR鑒定Fig.1 Identification of potential causative agent of avian severe respiratory disease by RT-PCR

呼吸道病是目前養(yǎng)禽業(yè)臨床上常見的一種疾病，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害嚴(yán)重。多種病原可以引起雞的呼吸道癥狀，包括AIV、NDV、IBV 及支原體等，快速鑒定引起呼吸道疾病的病原對(duì)疫病的迅速防控具有重要意義，目前臨床上廣泛應(yīng)用PCR方法對(duì)禽呼吸道疾病的快速診斷[7,10]，其具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。

2.3 分離株全長(zhǎng)S1 基因擴(kuò)增及遺傳演化分析 將鑒定為IBV陽(yáng)性的樣品RNA反轉(zhuǎn)錄后為模板，利用S1基因全長(zhǎng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示擴(kuò)增出預(yù)期大小的全長(zhǎng)S1 基因片段（圖2）。測(cè)序分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)本研究分離到的病原為IBV，命名為CK/Shanxi-01/2021株。

圖2 分離病毒全長(zhǎng)S1基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 Amplification of full-length S1 gene by PCR

為了進(jìn)一步研究所分離IBV 的遺傳進(jìn)化關(guān)系，將CK/Shanxi-01/2021株和其他基因型代表性株的全長(zhǎng)S1基因序列比對(duì)及遺傳演化分析。Blast 分析結(jié)果顯示CK/Shanxi-01/2021 與2011 年分離自雞的一株ck/CH/LHB/111190的同源性最近，為98.97%；序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)分離株與GI-19基因型中LX4及QX兩株代表株的同源性分別為95.8%及96.1%；而與目前國(guó)內(nèi)市售疫苗株H120 的 同 源 性 僅 為78.1%, 與 疫 苗 株4/91 同 源 性 為78.7%，與疫苗株LDT3-A 同源性為85.2%。為了系統(tǒng)研究分離株的進(jìn)化關(guān)系及分支類型，參考已發(fā)表文獻(xiàn)的基因分型[6-7,11]，利用MAFFT 軟件進(jìn)行多重比對(duì)，并進(jìn)行遺傳演化分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，分離株CK/Shanxi-01/2021 與LX4 及QX 株 等IBV 毒株 親緣關(guān)系較近，且均為GI-19 基因型（圖3），而與H120、M41、H52、LDT-3A等市售疫苗株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。將分離株S1 基因與不同基因型代表株序列利用RDP4軟件進(jìn)行重組分析，未發(fā)現(xiàn)顯著重組現(xiàn)象。

圖3 2021年山西IBV分離株全長(zhǎng)S1基因與不同基因型參考株相應(yīng)基因序列的遺傳進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of full-length S1 gene of Shanxi/2021 IBV isolate and reference strains from different genotypes

多篇文獻(xiàn)報(bào)道GI-19基因型（QX-like株）逐漸成為我國(guó)目前IBV 流行的主要基因型之一，其他基因型如GI-7（TW-like）、GI-13（4/91-like）及GI-22（YN-like）也經(jīng)常被分離到[7-8,12-14]。可見在我國(guó)流行的IBV株具有基因多樣性，多種不同基因型同時(shí)流行以及目前IBV弱毒疫苗株的普遍應(yīng)用，進(jìn)一步增加了不同IBV 之間發(fā)生重組的可能性。這也可能是近年來(lái)IB的防控難度加大，導(dǎo)致IB疫情不斷出現(xiàn)的原因。

2.4 分離病毒S1 基因高變區(qū)（HVR）氨基酸多態(tài)性分析 由于IBV 本身基因組特點(diǎn)，在流行過(guò)程中極易發(fā)生突變或與其他病毒株發(fā)生重組產(chǎn)生變異株，從而導(dǎo)致發(fā)生新的疫情。其中S1 基因的高變異區(qū)突變率較高[7,10,15]，為了進(jìn)一步分析IBV 分離株CK/Shanxi-01/2021 的分子特征，本研究對(duì)其S1 蛋白氨基酸多態(tài)性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，該分離株S1 蛋白HVR 區(qū)存在多個(gè)氨基酸突變，其與原來(lái)經(jīng)典GI-19 基因型病毒株氨基酸序列相比，在高變異區(qū)存在V68I、S120A、A271T、N282T、N291S 等突變。

將該分離株S1 基因與目前國(guó)內(nèi)市售IBV 疫苗株H120、4/91、M41、H52 及LDT3-A 株序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，山西分離株S1 基因與IBV 常用疫苗株S1 基因的核苷酸序列同源性為78.1%～85.2%，氨基酸序列的同源性僅為75.2%～78.4%，S1 蛋白已經(jīng)發(fā)生明顯變異。與H120 疫苗株相比，分離株S1 蛋白發(fā)生S54T、S57T、V68I、H120A、T157R 等突變，這些突變位于S1 蛋白主要受體結(jié)合區(qū)[16]。該發(fā)病肉雞場(chǎng)中盡管已經(jīng)免疫H120 疫苗，依然發(fā)生IB 疫情，推測(cè)是由于流行株抗原變異，而疫苗株免疫保護(hù)力不夠所致。因此，為有效防控IB 疫情，必須進(jìn)一步加強(qiáng)IBV 流行病學(xué)監(jiān)測(cè)工作，及早發(fā)現(xiàn)IBV 變異株，為科學(xué)合理防控策略的制定提供參考依據(jù)。