陳翠翠，鐘樹海，賴宏銳，梁煥坤，郭桂玲，李來慶

（廣州優(yōu)迪生物科技股份有限公司，廣東 廣州 510663）

非洲豬瘟（Infection with African swine fever virus，ASF）是由ASF 病毒（ASFV）引起豬的一種高度接觸性傳染病，所有品種和年齡的家豬和野豬均易感，臨床表現(xiàn)為皮膚發(fā)紺、發(fā)熱、淋巴結(jié)、腎及胃腸黏膜出血等[1]。ASF 發(fā)病過程短，死亡率高達100%，對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大危害[2]。ASF 首先暴發(fā)于非洲大陸，并逐漸向歐洲、亞洲等國家蔓延。由于該病毒特殊的免疫逃避機制，目前尚無有效治療手段和商品化疫苗[3-4]，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其定為一類疫病，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須通報動物疫病[5]。及時準確發(fā)現(xiàn)ASF 疫情，采用嚴格的生物安全措施，防止疫情蔓延，是防控ASF 疫情的主要措施。因此，建立一種高效靈敏、簡便快捷的ASF 檢測技術(shù)具有重要的現(xiàn)實意義。

ASFV 基因組龐大，有150 多個主要開放閱讀框，可編碼約200 種蛋白。作為ASFV 的主要結(jié)構(gòu)蛋白，P54 蛋白由ASFV El83L 編碼，最早出現(xiàn)在病毒復(fù)制早期，是血清抗體的主要結(jié)合位點，具有良好的免疫原性，在ASFV 進入機體后可產(chǎn)生針對該蛋白的特異性抗體[6]。以P54 蛋白為檢測抗原對歐洲和西非類型ASFV 的檢測方法具有高度敏感性和特異性[7]。

時間分辨熒光免疫法（Time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）是一種建立在免疫吸附分離和時間分辨熒光技術(shù)基礎(chǔ)上的超靈敏檢測方法，具有高精度、自動化大樣本快速測定（1 h～2 h 就能出結(jié)果）等優(yōu)點，其敏感性和準確性明顯高于ELISA 方法，特異性又明顯高于常規(guī)PCR[8]。TRFIA 發(fā)展迅速，已廣泛應(yīng)用于臨床疫病、食品安全快速檢測等領(lǐng)域[9]。目前，尚無ASFV 抗體檢測的TRFIA 的報道?；诖耍緦嶒灷肁SFV 重組P54 蛋白（rP54）作為包被原、Eu3+標記的rP54 抗原作為檢測抗原，建立一種ASFV 抗體的雙抗原夾心TRFIA，為ASF 的快速、精準檢測提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 ASFV rP54（原核表達）及其單克隆抗體（MAb）由廣州優(yōu)迪生物科技股份有限公司制備。96 孔板購自Costar 公司；銪（Eu3+）標記試劑盒和Victor 1420 全自動TRFIA 檢測儀購自PerkinEl?mer 公司；Sephades-G50 填料購自GE 公司；包被緩沖液、洗滌液、封閉液、分析緩沖液、增強液均為廣州優(yōu)迪生物科技股份有限公司制備。23 份疑似ASF 患病豬的口鼻咽拭子/血清，100 份健康豬ASFV陰性口鼻咽拭子/血清樣品、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、豬呼吸道冠狀病毒（Porcine respiratory coronavirus，PRCV）和豬凝血性腦脊髓炎病毒（Porcine hemagglutinating en?cephalomyelitis virus，PHEV）陽性豬血清均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.2 抗原的制備

1.2.1 固相包被抗原的制備 利用50 mmol/L、pH 9.6 的 包 被 緩 沖 液 將rP54 分 別 稀 釋 為2 μg/mL、4 μg/mL 和8 μg/mL，加入96 孔板中包被，利用方陣法優(yōu)化包被濃度。4 ℃包被過夜，棄包被液，加入200 μL 封閉液（5% BSA 的PBS 溶液，pH7.4），37 ℃封閉2 h，棄封閉液，PBST 洗滌2 次，于-20 ℃封閉保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Eu3+標記抗原的制備 將1 mg rP54 加到帶有濾膜的離心管中，以8 000 r/min 離心5 min，標記緩沖液洗滌5 次。利用方陣法優(yōu)化Eu3+標記試劑與rP54 的標記比例，即1 mg rP54 中分別加入100 μL、125 μL、150 μL、200 μL 的Eu3+標記試劑。分別充分混勻后，25 ℃振蕩過夜。標記完成后加入到Sep?hadex G-50 層析柱中純化，用含9 g/L NaCl 的50 mmol/L Tris-HCl 的洗脫液洗脫。收集流出液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 TRFIA 各反應(yīng)條件的優(yōu)化 向已包被rP54 的96孔酶聯(lián)板中依次加入不同體積（20 μL、30 μL、40 μL 和50 μL）的標準品或待測樣品，再加入200 μL分析緩沖液，室溫振動孵育1 h，洗滌4 次后，加入不同體積（100 μL、150 μL、200 μL、250 μL）Eu3+標記的rP54，室溫孵育30 min。洗滌液洗滌6 次后每孔加入不同體積（150 μL、200 μL、250 μL）增強液，振搖5 min 后，在Victor 1420 熒光檢測儀上檢測熒光值。采用方陣法分別優(yōu)化待測樣品體積、Eu3+標記抗原及增強液加入量。

1.4 標準曲線的繪制 將本公司制備并純化的ASFV rP54 MAb 分別配制成濃度為0、0.1 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL 的系列標準品溶液。每個濃度測定3 個復(fù)孔，共測定3次，利用雙對數(shù)數(shù)學(xué)模型（Log-Logit）進行標準曲線的擬合得出標準曲線方程。

1.5 cut off 值的確定 利用該TRFIA 檢測100 份健康豬血清樣品中的ASFV 抗體濃度。利用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。結(jié)果屬于正態(tài)分布的，用正態(tài)分布法計算參考區(qū)間范圍，其95%參考區(qū)間范圍分別用下式計算：cut off=+1.96s。

1.6 特異性試驗 利用本研究建立的TRFIA 同時檢測ASFV rP54 MAb 標 準 品（100 ng/mL）、 TGEV、PRCV 和PHEV 陽性豬血清，評估該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗 利用本研究建立的TRFIA 檢測不含ASFV MAb 標準品的溶液，重復(fù)檢測10 次。以不含ASFV MAb 標準品的溶液為檢測對象，將測定的10 次熒光值平均值加上2 倍的標準差代入標準曲線方程，計算TRFIA 的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗 將已知濃度的ASFV rP54 MAb 標準品加入到不含ASFV 抗體的健康豬血清中，制備成高、中、低3 個濃度（濃度分別為10 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL）。同一時間點重復(fù)檢測10次高、中、低濃度樣品，計算平均數(shù)（-x）、標準差（s）、回收率（測定濃度/加入濃度×100）及變異系數(shù)（CV），評價該方法批內(nèi)重復(fù)性。在3 個不同時間點重復(fù)檢測10 次上述高、中、低濃度樣品，獲得平均數(shù)、標準差、回收率及CV，評價該方法批間重復(fù)性。

1.9 穩(wěn)定性試驗 制備TRFIA 試劑盒并置于37 ℃7 d 后，對試劑盒的物理外觀，劑量-反應(yīng)曲線的線性、敏感性、準確性、特異性等指標進行測定，具體檢測方法同上，檢測試劑盒的穩(wěn)定性。

1.10 臨床樣品的檢測 采集23 份疑似ASF 患病豬、20 份健康豬口鼻咽拭子/血清樣品，采用本研究建立的TRFIA（檢測血清樣品）、PCR[10]（檢測口鼻咽拭子）和ELISA 方法[11]（檢測血清樣品）分別檢測，對結(jié)果進行配對卡方檢驗（McNemar test）和一致性檢驗（Kappa test），以評估該TRFIA 的臨床檢測效果。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果以±s表示，利用GraphPad Prism 5 軟件繪制標準曲線并擬合得到標準曲線方程。

2 結(jié) 果

2.1 TRFIA 反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果 對包被濃度、Eu3+標記試劑使用量、反應(yīng)體系的體積等條件進行優(yōu)化，確定了TRFIA 最佳反應(yīng)條件為：rP54 包被濃度為4 μg/mL，100 μL/孔；使用150 μL Eu3+標記試劑標記1 mg rP54；反應(yīng)體系為30 μL 標準品或待測樣品+ 200 μL/孔Eu3+標記抗原+ 200 μL/孔增強液。

2.2 標準曲線的繪制 以不同濃度ASFV rP54 MAb的標準品為橫坐標，其對應(yīng)的熒光值為縱坐標，利用雙對數(shù)數(shù)學(xué)模型（Log-Logit）進行標準曲線的擬合后得到的標準曲線（圖1），方程為：Y=0.2875x+3.1517，MAb 線 性 范 圍 為0.1 ng/mL～1 000 ng/mL，R2=0.9930，表明該檢測方法具有良好的劑量-反應(yīng)效應(yīng)。

圖1 TRFIA的標準曲線Fig.1 Standard curve of TRFIA for detection of ASFV antibodies

2.3 cut-off 值的確定 將100 份健康豬血清樣品經(jīng)該TRFIA 檢測，經(jīng)標準曲線方程計算得到的抗體濃度使用SPSS 19.0 進行正態(tài)性檢驗，結(jié)果顯示，抗體濃度呈正態(tài)分布（圖2），因此采用95%參考區(qū)間范圍 計 算cut off 值（cut off=+1.96s）。100 份 健 康 豬ASFV 抗體平均濃度為1.95 ng/mL，s為0.29，計算得到cut off 值為2.52 ng/mL。即檢測樣品的抗體濃度值大于2.52 ng/mL 時，為ASFV 陽性樣品；抗體濃度值小于2.52 ng/mL 時，為ASFV 陰性樣品。

圖2 100份健康豬血清ASFV抗體濃度正態(tài)分布圖Fig.2 Normal distribution(Bell Curve)of antibodies against ASFV in 100 serum samples of healthy pigs

2.4 特異性試驗結(jié)果 利用本研究制備的TRFIA 檢測100 ng/mL ASFV MAb 標準品的濃度為98.93 ng/mL，為陽性；而同步檢測TGEV、PRC 和PHEV 陽性豬血清，經(jīng)計算抗體濃度分別為1.26 ng/mL、2.02 ng/mL、1.95 ng/mL，均為陰性，該方法與這些相關(guān)病毒抗體均無明顯交叉反應(yīng)，表明該方法特異性較強。

2.5 敏感性試驗結(jié)果 平行測定10 次不含MAb 的標準品的熒光值，并計算其及s值，用+2s代入標準曲線方程，計算得出該TRFIA 的檢測下限為0.067 ng/mL，表明該方法敏感性較高。

2.6 重復(fù)性試驗結(jié)果 重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，高、中、低3個濃度ASFV rP54 MAb標準品批內(nèi)重復(fù)性試驗的 回 收 率 在95.80%～105.62%，批 內(nèi)CV 在3.11%～8.77%；3 個濃度ASFV rP54 MAb 標準品批間重復(fù)性試驗的回收率在92.50%～108.97%，批間CV在4.28%～10.59%。批內(nèi)變異系數(shù)小于10%，批間變異系數(shù)小于15%（表1）。表明該TRFIA 的重復(fù)性較好。

表1 TRFIA的重復(fù)性試驗結(jié)果Table 1 The accuracy and repeatability of TRFIA kit

2.7 穩(wěn)定性試驗結(jié)果 將本研究制備的ASFV 抗體TRFIA 試劑盒置于37 ℃7 d，進行加速熱穩(wěn)定性試驗。結(jié)果顯示，37 ℃保存7 d，ASFV MAb 標準品的各點熒光值并未隨著條件的改變而發(fā)生明顯變化，試劑盒的檢測性能也無明顯改變。表明該TRFIA 試劑盒穩(wěn)定性較好。

2.8 臨床樣品的檢測結(jié)果 利用本研究制備的AS?FV 抗體TRFIA 與PCR 法、ELISA 法同時檢測23 份疑似患病豬和20 只健康豬的口鼻咽拭子/血清樣品。檢測結(jié)果顯示，TRFIA 和PCR 法同時檢測出4 份AS?FV 陽性樣品，其余均為陰性樣品，兩種檢測方法的檢測結(jié)果一一對應(yīng)、完全一致。ELISA 法檢測出2只健康豬血清樣品為陽性，其余樣品檢測結(jié)果與PCR 法一一對應(yīng)、完全一致。利用SPSS 軟件進行TRFIA 與PCR 法的配對卡方檢驗（McNemar test）的P值為1.00，一致性檢驗（Kappa test）的Kappa 值為1.00，提示這兩種方法檢測結(jié)果的一致性較高（符合率100%），且準確性均高于ELISA 法（表2）。表明，本研究建立的TRFIA 準確性較好，可用于豬臨床樣品的檢測。

表2 3種方法對臨床樣品的檢測結(jié)果Table 2 McNemar test results of the TRFIA,PCR and ELISA

3 討 論

ASFV 自1921 年首次在肯尼亞發(fā)現(xiàn)后已蔓延至全球，中國于2018 年8 月首次發(fā)現(xiàn)該病[12]。我國作為一個養(yǎng)豬大國，近年來ASF 頻繁暴發(fā)，給我國的養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴重危害。目前，ASF 診斷技術(shù)的國家標準已于2020 年12 月14 日發(fā)布并實施，主要有分子生物學(xué)檢測法、熒光免疫分析法、ELISA 抗原和抗體檢測法等[13]。針對ASFV 的特點，研制出特異性強、敏感性高的檢測新方法對于預(yù)防ASF 的傳播至關(guān)重要?；赑54 蛋白的結(jié)構(gòu)特點和重要作用，我國研究者已利用P54 蛋白建立了ASFV 抗體檢測方法，敏感性為200 ng/mL，且與豬其他病毒陽性血清無交叉反應(yīng)，特異性較強，可用于ASFV 感染動物血清抗體的監(jiān)測[14-15]。

然而，目前對ASFV 抗原、抗體的檢測方法均為定性檢測[14-18]，僅可確定是否感染ASFV，對于感染程度、機體免疫反應(yīng)情況等均無法判斷。本研究利用rP54 包被酶聯(lián)板、Eu3+標記rP54 抗原，建立了一種既可定性又可定量檢測ASFV 抗體的新方法。該方法對ASFV 抗體檢測的敏感性為0.067 ng/mL，cut off 值為2.52 ng/mL，可同時實現(xiàn)ASFV 抗體的定量和定性分析，彌補了現(xiàn)有ELISA 法只能定性檢測的缺陷。對不同濃度ASFV P54 MAb 標準品的批內(nèi)和批間回收率在92.50%～108.97%，批內(nèi)和批間CV均小于15%，達到臨床檢測對準確性和重復(fù)性的要求，可用于臨床樣品的檢測；臨床樣品比較檢測中，該TRFIA 與傳統(tǒng)的PCR 法檢測結(jié)果的一致性較高（符合率100%），準確性高于存在假陽性結(jié)果的ELISA 法，表明該方法檢測結(jié)果準確性較高，可替代傳統(tǒng)的PCR 法和ELISA 法。

TRFIA 作為一種超微量檢測方法，具有定量、準確、特異性強、敏感性高等優(yōu)點，不僅可為ASF的快速、精準檢測提供一種新的技術(shù)手段，也為其他動物類病毒傳染病的檢測發(fā)揮重要作用[19-20]。