季 佳，張振興，薛曉巖，王雯慧，韓聯(lián)憲，代紅煬，李高銀，段博芳，張文東，劉 強，李素華*，宋建領*

（1.西南林業(yè)大學生命科學學院/國家高原濕地研究中心，云南 昆明 650224；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學院云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南 昆明 650224；3.會澤黑頸鶴國家級自然保護區(qū)管護局，云南 曲靖 654200；4.昭陽區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南 昭通 657000；5.云南省動物疾病預防控制中心，云南 昆明 650034）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）屬于正黏病毒科流感病毒屬的A 型流感病毒，其基因組由8 個節(jié)段的單股負鏈RNA 組成，可編碼11 種不同的蛋白[1]，其中表面蛋白血凝素（Haemagglutinin，HA）和神經氨酸酶（Neuraminidase，NA）的組合可以產生不同的亞型。自1998 年以來，H9N2 亞型AIV 已在我國大部分地區(qū)持續(xù)流行20 多年，病毒在流行過程中持續(xù)進化，基因遺傳特征產生一定的變異，形成具備感染哺乳動物的能力或導致致病力增強，甚至成為H5N1（如A/Hong Kong/156/97 株）[2]、H7N9（如A/Shanghai/1/2013）[3]、H10N8（如A/Jiangxi-Donghu/346/2013 株）[4]等可感染人的流感病毒的內部基因供體。此外，當同一細胞感染兩個或者多個不同的病毒時，H9N2 AIV 各亞群或與其他亞型AIV 的8 個基因節(jié)段之間可進行廣泛的基因重組，產生一系列基因型特異的新亞型病毒，目前我國國內流行的H9N2 AIV 已進化出A～W 等眾多的基因型[5]。

野生水禽尤其是雁形目、鸻形目的野禽被認為是AIV 的天然宿主，病毒在野禽腸道上皮細胞高效復制，通過糞便污染水源進行AIV 的有效傳播[6]。云南拉市海高原濕地自然保護區(qū)于2004 年被列入“國際重要濕地”，不僅是候鳥遷徙通路上的重要停歇地，也是眾多候鳥的重要越冬地，水禽資源豐富，目前已記錄到的17 目44 科236 種鳥類中，水禽有89 種，約10 萬只[7]。在云南拉市海高原濕地開展野禽及家禽的AIV 監(jiān)測工作極其重要，本實驗在AIV 監(jiān)測研究中，分離到3 株H9N2 AIV，通過生物信息學分析探究了分離株的基因遺傳進化及分子變異特征，為揭示AIV 在野禽和家禽中傳播及掌握病毒分子進化趨勢提供基礎數(shù)據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 病毒RNA 提取試劑盒（QIAamp?Viral RNA Mini Kit）購自德國QIAGEN公司；一步法RT-PCR試劑盒（PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit）購自寶生物工程（大連）有限公司；青霉素和鏈霉素購自上海碧云天生物技術有限公司；慶大霉素和制霉菌素購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；樣品保存液為pH7.0～pH7.4，含青霉素2 000 IU/mL、鏈霉素2 mg/mL、慶大霉素50 μg/mL 及制霉菌素1 000 IU/mL 的PBS 溶液；SPF雞胚購自北京媯川亞申養(yǎng)殖中心有限公司。

1.2 樣品采集 于2020 年3 月～2021 年3 月在云南拉市海高原濕地采集到實驗樣品1 807 份，其中野禽新鮮糞便樣品1 367 份，包括：紅嘴鷗500 份、斑頭雁450 份、灰雁387 份和灰鶴30 份，家禽泄殖腔拭子樣品420 份以及環(huán)境水樣20 份。野禽糞便樣品采集時，通過高倍望遠鏡遠距離觀察拉市海高原濕地灘涂的野禽種類及大致種群數(shù)量，重點跟蹤斑頭雁、灰鶴、灰雁、黑頸鶴及紅嘴鷗等涉水野禽的種群。選擇1 h內的新鮮糞便，根據糞便形態(tài)特征確定來源的野禽種屬后，立即置入盛有樣品保存液的凍存管。家禽泄殖腔樣品來自拉市海濕地保護區(qū)緩沖區(qū)外的家禽散養(yǎng)戶養(yǎng)殖的無臨床癥狀的雞。環(huán)境水樣包括野禽生境地的沼澤水以及散養(yǎng)戶的養(yǎng)殖排放污水。盛有樣品的凍存管，放入干冰中，24 h 內運回實驗室。

1.3 病毒分離 采集的糞便樣品、泄殖腔拭子和水樣經研磨及渦旋振蕩后，8 000 r/min 離心3 min，取上清液加入青霉素（工作濃度2 000 IU/mL）和鏈霉素（工作濃度2 mg/mL），放置4 ℃冰箱過夜處理。將處理后樣品按每胚200 μL 經尿囊腔接種于10 日齡SPF雞胚，每份樣品接種5 枚，置37 ℃恒溫箱孵育，收取死胚及96 h 活胚的尿囊液，盲傳2 代后，測定其血凝活性，無菌收集血凝效價高于4 log2 的雞胚尿囊液，視為AIV 可能陽性的樣品。

1.4 分離病毒的RT-PCR 擴增 提取血凝陽性雞胚尿囊液的病毒RNA，參考文獻[8]合成AIV M基因檢測引物AIF/AIR，參考文獻[9]合成可同時擴增AIV全基因組8個節(jié)段的引物MBTuni-12/13，經一步法RT-PCR分別擴增M基因和8個基因節(jié)段。M基因擴增的反應程序為：50 ℃30 min；94 ℃2 min；94 ℃30 s、45 ℃30 s、72 ℃1 min，35個循環(huán)；72 ℃10 min。AIV 8個基因節(jié)段擴增的反應程序為：42 ℃60 min；94 ℃2 min；94 ℃30 s、45 ℃30 s、68 ℃3 min，5 個循環(huán)；94 ℃30 s、57 ℃30 s、68 ℃3 min，31個循環(huán)。以本實驗室保存的A/chicken/Yunnan/1/2019（H9N2）（簡稱CK/YN/1/19）株作為陽性對照，以不加模板的反應體系作為陰性對照。

1.5 分離病毒RT-PCR 產物的測序分析 RT-PCR產物經回收純化后由上海伯豪生物技術有限公司進行二代測序分析。擴增產物利用Illumina 公司nex?tRAD 法構建測序文庫，通過Illumina Miseq 測序平臺完成測序，采用CLC Genomics Workbench 對測序讀段Reads 組裝的Contigs 進行拼接，從而得到編碼蛋白基因（Unigens）的序列集合[10]，將基因核酸序列翻譯為氨基酸序列，在GenBank 的非冗余蛋白質數(shù)據庫（Non-redundant protein databasse，NR）進行同源性比對，獲取AIV 蛋白的相似性序列。

1.6 分離病毒的生物信息學分析 成功注釋為AIV各基因節(jié)段的序列通過NCBI BlAST 工具進行同源性比對，分析與8 個節(jié)段相似性較高的AIV，并下載H9N2 AIV 參考序列，以MEGA 7.0 的Clusta W 多序列比對和鄰近法（Neighbor-joining，NJ）構建遺傳進化樹，可靠性通過1 000 Bootstrap 值評估，利用Laser?gene 軟件將分離株8 個基因節(jié)段翻譯為蛋白質序列，分析流感病毒關鍵氨基酸位點突變情況，并通過NetNGlyc 1.0 server預測HA和NA蛋白糖基化位點。

2 結 果

2.1 病毒的分離鑒定結果 將經血凝試驗鑒定為AIV陽性樣品M 基因的RT-PCR 擴增結果顯示，有3 份樣品出現(xiàn)預期目的條帶（圖1A），初步表明其為AIV陽性；其中2 份樣品為家禽泄殖腔拭子，1 份為斑頭雁糞便樣品，家禽樣品的AIV 陽性分離率為0.48%（2/420），野禽樣品的AIV 陽性分離率為0.07%（1/1367）。3 株AIV M 基因陽性分離株均擴增到AIV 全基因組的8 個節(jié)段（圖1B），8 個基因節(jié)段經測序及NCBI BLAST 分析結果表明，3 株分離株均為H9N2 亞型AIV，分別命名為：A/chicken/Yunnan/LSH14/2021（H9N2）（簡稱CK/YN/LSH14/21 株）、A/chicken/Yunnan/LSH16/2021（H9N2）（簡稱CK/YN/LSH16/21 株）、A/bar headed goose/Yunnan/LSH142/2021（H9N2）（簡 稱BHG/YN/LSH142/21株）。

圖1 RT-PCR擴增AIVs M基因和全基因組Fig.1 RT-PCR amplification of M gene and whole genome of AIVs

2.2 分離病毒8 個基因節(jié)段的遺傳進化分析 核苷酸同源性分析結果顯示，3 株H9N2 AIV 分離株HA基因的同源性為97.1%～97.4%，與A/chicken/Guangxi/55/2005（H9N2）同源性為92.3%～92.6%；NA 基因的同源性為97.5%～98.6%，與A/chicken/Jiangsu/WJ57/2012（H9N2）疫苗株同源性為91.3%～91.4%。將分離株與H9N2 AIV 代表株進行遺傳進化分析，結果顯示，3株分離株的HA基因均位于h9.4.2.5分支（圖2），NA 基因均位于n2.1.4分支（圖3），這兩個分支均屬于歐亞譜系的Y280-like 亞群，PB2、M 基因屬于歐亞譜系的G1-like亞群，PB1、PA、NP和NS基因屬于歐亞譜系的F/98-like亞群，由此可推測3株分離株均為重組病毒，且與我國流行的H9N2 AIV S基因型重組模式一致（圖4），與早年流行的A 和H 基因型相比，S 基因型在家禽中具有更強的傳染性[5]。研究顯示具有G1-like 特性的M 基因可增加AIV 對人的感染[11]，CK/YN/LSH14/21分離株M 基因核苷酸序列與人源A/Beijing/1/2017（H9N2）株M基因序列同源性高達99.30%，提示禽源H9N2 AIV可作為重組人源病毒的供體。

圖2 3株H9N2分離株HA基因的遺傳進化樹Fig.2 The phylogenetic tree of the HA genes of the three H9N2 isolates

圖3 3株H9N2 AIV分離株NA基因的遺傳進化樹Fig.3 The phylogenetic tree of the NA genes of the three H9N2 isolates

圖4 3株H9N2 AIV分離株的S基因型重組模式Fig.4 The S genotype recombination model of the three isolated viruses

2.3 分離病毒8 個基因節(jié)段的特征性氨基酸位點的分析 將3 株H9N2 AIV 分離株與參考株A/Chicken/Beijing/1/94（H9N2）、A/Chicken/Shanghai/F/98（H9N2）和A/chicken/Guangxi/55/2005（H9N2）比對，進行流感病毒特征性氨基酸位點分析（表1）。HA 蛋白氨基酸特征性位點分析結果顯示，3 株H9N2 AIV HA 蛋白的裂解位點均為333PSRSSR↓GLF341，無連續(xù)的堿性氨基酸（K、R、H），表明3 株H9N2 AIV 符合低致病性AIV 的 特 征[12]；HA 蛋 白 的Y109、W161、T163、N191、L202、Y203（H9 編號）等氨基酸位點高度保守，但發(fā)生了疫苗接種地區(qū)流行株特征性N166D 突變以及增加跨種感染哺乳動物能力的A198T 和Q234L 變異[13-14]，其中A198T 則可增強病毒與受體的親和力，Q234L 變異則使得病毒具有與人上呼吸道上皮細胞表面的唾液酸α-2, 6 半乳糖（SA α-2, 6 Gal）受體結合的特性；由于HA 蛋白發(fā)生T220I、P315S 突變，導致218 位糖基化位點缺失，在313 位點新增一個糖基化位點，兩個糖基化位點的改變可微弱增強AIV 在組織中的復制能力[15]。

表1 3株H9N2 AIV分離株的病毒傳播能力及與致病力相關氨基酸位點分析Table 1 Analysis of the special amino acid sites associating with viral pathogenicity and transmission of the three isolated viruses

NA 蛋白氨基酸特征性位點分析顯示，頸部aa63～aa65 位點缺失，這種缺失是中國大陸雞源H9N2 AIV 的標志[16]，提示本實驗中分離到的野禽來源的分離株可能來自家雞感染，這種氨基酸位點的缺失也導致NA 蛋白產生Y280-like 亞群特征性的61位糖基化位點缺失[17]。

3 株分離株內部基因編碼蛋白的特征性氨基酸位點分析顯示，PB2 蛋白存在與小鼠致病力增強相關的L89V、G309D、T339K 氨基酸替換[18]，但未發(fā)現(xiàn)與跨越物種屏障感染哺乳動物以及致病力增強相關的E627K 和D701N 突變；此外3 株H9N2 AIV 分離株的PB1蛋白D622G、M1 蛋白N30D 和T215A、M2 蛋白S31N 以及NS1 蛋白P42S 等與病毒致病力增強的位點均發(fā)生了突變，這些內部基因的突變在H9N2 AIV 的適應性進化中至關重要[19-21]。本實驗中分離到的野禽源H9N2 AIV 與2 株家禽源AIV 的分子特征僅在PA 蛋白N383D 的突變具有差異性，這種突變可增強病毒聚合酶活性的突變[22]，野禽源H9N2 AIV 無該突變。

3 討 論

世界范圍分布的H9N2 AIV，在遺傳進化上可依據地域分布特征分為北美譜系和歐亞譜系兩大分支[2]。2012 年我國研究者對GenBank 數(shù)據庫中千余條H9 亞型AIV 的HA 序列分析，將其分為h9.1～h9.4 4 個進化分支[23]。h9.1 和h9.2 分別為上世紀60 年代和90 年代的北美地區(qū)分離株；h9.3 分支為上世紀70年代持續(xù)至今的分離株，覆蓋的地域包括亞洲、歐洲、非洲、太平洋和北美等地；h9.4 分支則對應從1994 年以來亞洲流行的分離株，也是最為龐大的分支，包括兩個亞分支h9.4.1（即以A/quail/Hong Kong/G1/97 株為代表的G1-like 亞群）和h9.4.2（即以A/duck/Hong Kong/Y280/97 株 為 代 表 的Y280-like 亞 群）。h9.4.2 全部是中國的分離株，可進一步進行四級細分，其中h9.4.2.1～h9.4.2.4 進化分支代表2007 年之前國內H9N2 AIV 分離株，2007 年出現(xiàn)了我國日趨流行以A/chicken/Guangxi/55/2005 株為代表的h9.4.2.5 分支，2010 年又出現(xiàn)了以A/chicken/Guangdong/FZH/2011 株 為 代 表 并 呈 蔓 延 趨 勢 的h9.4.2.6 分 支，但 當前我國仍以h9.4.2.5 分支的流行株為主?；贏IV 各基因系統(tǒng)發(fā)育的基礎，我國研究者將H9N2 AIV 在中國的演變聚類成具有明顯時空特征的A～W 基因型，其中在中國雞群中A、H 和S 型H9N2 AIV 分別在不同時期占據主導地位[5]。研究者將A 基因型定義為分離株全部基因均來自BJ/94-like；H 基因型定義為分離株的3 個聚合酶基因PA、PB1、PB2 以及NP 基因均來自F/98-like 而其他基因來自BJ/94-like；S 基因型是在H 型基礎上出現(xiàn)的由G1-like 提供PB2 和M 基因；90 年代早期，我國以A 基因型流行為主，2000 年開始流行在家禽中具有更好適應性的H 基因型，2007 年以后S 基因型逐漸在雞群中穩(wěn)定流行。流行病學研究表明我國當前流行的H9N2 AIV 仍為S 基因型[24]。

本實驗分離自云南拉市海高原濕地的野禽及家禽來源的H9N2 AIV 屬于我國當前流行的h9.4.2.5 分支，同屬于S 基因型。值得注意的是這株分離自斑頭雁的H9N2 AIV 也具有當前中國雞源AIV 標志性的NA 蛋白莖部結構中aa63～aa65 的缺失[16]，同時存在疫苗接種地區(qū)流行株特征性HA 蛋白N166D 突變[13]，推測本實驗分離的野禽源AIV 可能來自家禽的傳播感染。本研究揭示AIV 可能存在由家禽向野禽傳播，為家禽養(yǎng)殖業(yè)的生物安全防護提出了更高的要求。

野禽導致的禽流感疫情風險受到了研究者的普遍關注。野生水禽和家養(yǎng)水禽通過水環(huán)境密切接觸，易將AIV 傳播給家禽，2015 年發(fā)生在歐洲的H5N8 高致病性AIV 經證實即是由野生水禽傳染給家禽[25]，尤其是遷徙性涉水禽類通過長距離的遷徙活動在全球AIV 傳播中起著重要作用[26]。云南拉市海高原濕地位于中亞遷徙線和東亞-澳大利亞遷徙線兩條全球候鳥通道的交匯處，由于獨特的地理位置和適宜的生境，每年冬季大量遷徙野鳥在此越冬或停歇，野鳥種群數(shù)量約10 萬只[7]。斑頭雁、灰雁、黑頸鶴和灰鶴等涉水野禽均有較大的種群數(shù)量在此越冬，斑頭雁種群數(shù)量約7 萬只，在全球分布廣泛，每年可沿著中亞遷徙線飛越喜馬拉雅山脈，在中亞和南亞之間長距離遷徙[27-28]。處于候鳥遷徙路線的重要十字路口，拉市海高原濕地豐富的野生水禽資源，帶給家禽的流行病學風險以及對人類健康的潛在威脅不容忽視。

本實驗中的3 株H9N2 AIV 分離株與我國其它地區(qū)分離到同型病毒存在相似的分子變異趨勢，如與人源H9N2 AIV 高度同源的M 基因[29]，可增加跨種感染風險、導致與哺乳動物致病力增強相關的A198T、Q234L（HA），L89V、G309D、T339K（PB2），D622G（PB1），N30D、T215A（M1），P42S（NS1）突變[19-21]。雖然野禽源H9N2 AIV 與家禽分離株有著幾近相同的氨基酸變異位點，前者缺失PA 蛋白N383D 突變位點，如前所述病毒在天然宿主體內溫和復制，不表現(xiàn)臨床癥狀，因此野禽源AIV 無該突變，可能是病毒對天然宿主的適應性改變。這些研究結果提示，持續(xù)監(jiān)測野禽攜帶AIV 的變異情況，并分析其與家禽源AIV 的相似性，探究分離株的跨種屬傳播能力，可以為禽流感綜合防控供基礎數(shù)據。