李鑫 趙雪 卓愷明 劉登堂 禹順英

既往動(dòng)物研究顯示腸道菌群與學(xué)習(xí)記憶障礙、精神運(yùn)動(dòng)亢進(jìn)等精神分裂癥樣行為有關(guān)[1]。臨床研究顯示，精神分裂癥患者與健康對(duì)照比較，部分腸道菌群菌種比例和多樣性存在差異[2-3]。還有研究指出菌種水平與精神分裂癥的癥狀嚴(yán)重程度存在關(guān)聯(lián)[4]。在精神分裂癥的腸道菌群研究中，抗精神病藥是干擾因素，因?yàn)橛凶C據(jù)顯示幾乎所有抗精神病藥物都具有一定的抗生素活性[5]。目前針對(duì)未使用抗精神病藥的精神分裂癥患者腸道菌群研究尚不深入。因此，為排除藥物對(duì)患者腸道菌群的影響，本研究以首次發(fā)作且未使用抗精神病藥的精神分裂癥患者為研究對(duì)象，初步探索患者與對(duì)照間腸道菌群的差異，以及患者腸道菌群特征與精神癥狀之間的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象本研究為病例對(duì)照研究。2020年7月至2021年8月于上海市精神衛(wèi)生中心招募首次發(fā)作且未使用抗精神病藥的精神分裂癥住院患者為患者組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)《精神疾病診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第五版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,5th Edition,DSM-5）診斷為精神分裂癥；②首次發(fā)作，從未服用過抗精神病藥物；③年齡18～50歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有自身免疫性疾病、胃腸疾病、糖尿病；②患有其他精神疾?。虎墼袐D、哺乳期婦女；④近1個(gè)月內(nèi)曾使用抗生素；⑤近1個(gè)月有明顯腹瀉或便秘。

同期通過網(wǎng)絡(luò)宣傳在社區(qū)招募健康對(duì)照為對(duì)照組。入組標(biāo)準(zhǔn)：①無精神疾??；②從未服用過抗精神病藥物；③年齡、性別和體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI）與患者匹配。排除標(biāo)準(zhǔn)與患者組一致。

共納入42例首發(fā)未用藥精神分裂癥患者和47名健康對(duì)照。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有被試簽署知情同意書。

1.2 社會(huì)人口學(xué)特征和臨床癥狀評(píng)估通過與入組者訪談，記錄年齡、性別、民族、當(dāng)前吸煙狀況、BMI等資料。臨床精神科醫(yī)生對(duì)精神分裂癥患者進(jìn)行癥狀量表評(píng)定，包括精神病癥狀維度評(píng)定量表（clinician-rated dimensions of psychosis symptom severity,CRDPS）[6]和陽性與陰性癥狀量表（positive and negative syndrome scale,PANSS）[7]。

1.3 糞便樣本收集和16S rRNA測(cè)序

1.3.1 糞便樣本采集 用10 mL無菌密封集便盒取受試者新鮮糞便，在溫度4℃條件下，4 h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室-20℃保存。

1.3.2 樣品DNA提取 使用GHFDE100 DNA分離試劑盒（浙江杭州設(shè)備制備有限公司，20190952）提取糞便樣本細(xì)菌總基因組DNA。提取的DNA使用NanoDropND-1000分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，USA）和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA濃度和完整性鑒定。

1.3.3 16S rRNA基因測(cè)序和分析 對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Agencourt AMPure XP珠純化（Beckman Coulter,Indianapolis,IN），并用PicoGreen雙鏈DNA分析試劑盒（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）進(jìn)行定量。等量收集擴(kuò)增子后在Illumina NovoSeq6000平臺(tái)（Illumina,USA）進(jìn)行對(duì)端測(cè)序。此工作在杭州谷禾信息技術(shù)有限公司平臺(tái)完成。

1.4 生物信息學(xué)分析序列數(shù)據(jù)分析使用QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0，http://qiime.org/）和R包（v3.2.0）。用Illumina Novaseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序并得到原始數(shù)據(jù)，配對(duì)拼接成單條序列。用QIIME軟件對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)控過濾，得到有效序列。α-多樣性用QIIME軟件計(jì)算，其中Chao1指數(shù)用于估計(jì)群落中操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）數(shù)目，Shannon指數(shù)側(cè)重群落的豐富度以及稀有OTU，Simpson指數(shù)側(cè)重均勻度。β-多樣性分析利用OTU的豐度信息對(duì)unifrac距離構(gòu)建weighted unifrac距離。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法人口學(xué)資料分析采用SPSS 23.0，年齡、BMI、受教育年限和量表分?jǐn)?shù)用±s描述，組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。腸道菌群α-多樣性Chao1和Shannon指數(shù)符合正態(tài)分布，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，Simpson指數(shù)不符合正態(tài)分布，用Wald-Wolfowitz檢驗(yàn)；β-多樣性通過多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)方法主成分分析（principal component analysis，PCA）比較組間差異。腸道菌群豐度組間比較使用基于線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）的LEfSe分析，用LefSe軟件，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的LDA值（logarithmic LDA score）設(shè)為2。精神分裂癥患者腸道菌群與癥狀量表評(píng)分相關(guān)性分析使用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 社會(huì)人口學(xué)特征患者組和對(duì)照組年齡（P=0.50）、性別（P=0.19）、BMI（P=0.38）、受教育年限（P=0.51）和是否吸煙（P=0.30）沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

表1 首發(fā)未用藥精神分裂癥患者和健康對(duì)照的社會(huì)人口特征及臨床癥狀評(píng)估

2.2 腸道微生物群落結(jié)構(gòu)

2.2.1 α-多樣性分析 患者組和對(duì)照組α-多樣性的Chao1指數(shù)存在差異（t=2.36，P=0.01），對(duì)照組高于患者組，但Shannon（P=0.49）和Simpson（P=0.13）指數(shù)組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2。

表2 首發(fā)未用藥精神分裂癥患者與健康對(duì)照腸道菌群的α-多樣性分析

2.2.2 β-多樣性分析 PCA分析提取3個(gè)主成分，結(jié)果表明兩組間菌群組成存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），患者組腸道菌群聚類比對(duì)照組更緊密。見圖1。

2.2.3 腸道菌群物種組成豐度分析 LefSe分析顯示，患者組和對(duì)照組之間21個(gè)特征菌屬的豐度有差異（LDA值＞2）?；颊呓M腸道菌群中有4個(gè)綱富集，分別為α-變形菌綱、芽孢桿菌綱和紅蝽菌綱；2個(gè)目富集，分別為乳桿菌目和紅蝽菌目；3個(gè)科富集，分別為鏈球菌科、放線菌科和紫單胞菌科；5個(gè)屬富集，分別為放線菌屬、鏈球菌屬、厭氧菌屬、瘤胃球菌屬和副桿菌屬。對(duì)照組腸道菌群中有1個(gè)目富集，為巴斯德氏菌目；1個(gè)科富集，為巴斯德氏菌科；4個(gè)屬富集，分別是羅斯氏菌屬、毛螺菌屬、梭狀芽胞桿菌屬。見圖2。

2.3 腸道菌群水平與臨床癥狀相關(guān)性患者組毛螺菌屬（r=-0.49，P＜0.01）和枸櫞酸桿菌屬（r=-0.36，P=0.02）水平與CRDPS得分呈負(fù)相關(guān)，而考拉桿菌屬水平與CRDPS得分呈正相關(guān)（r=0.25，P=0.02）。鏈球菌屬水平與PANSS陰性癥狀得分呈正相關(guān)（r=0.39，P＜0.01），且與PANSS陽性癥狀得分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.31，P=0.04）。毛螺菌屬水平與PANSS一般精神病理量表得分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.33，P=0.03）。其他菌群水平與癥狀評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性（P＞0.05）。圖3列出與臨床癥狀相關(guān)的16個(gè)菌屬。

3 討論

本研究以首發(fā)未用藥精神分裂癥患者為研究對(duì)象分析精神分裂癥與健康對(duì)照腸道菌群多樣性和菌群構(gòu)成特征的差異。發(fā)現(xiàn)在α-多樣性上，雖然Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在患者組和對(duì)照組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但患者組Chao1指數(shù)低于對(duì)照組，說明首發(fā)未用藥精神分裂癥患者腸道菌群OTU數(shù)減少，其多樣性下降。在β-多樣性上，患者組與對(duì)照組腸道菌群也存在顯著差異。本研究有關(guān)α-多樣性的結(jié)果與部分研究有所不同，如既往研究[3-4,8-10]發(fā)現(xiàn)患者組和對(duì)照組腸道菌群α-多樣性的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Chao1指數(shù)均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但是，ZHENG等[2]的研究發(fā)現(xiàn)患者組和對(duì)照組在α-多樣性中Chao1和Shannon指數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究有關(guān)β-多樣性的結(jié)果也支持了LI等[8]的結(jié)論，即患者組與對(duì)照組之間β-多樣性存在差異。結(jié)合抗精神病藥有類抗菌作用的結(jié)論[5]，推測(cè)上述各項(xiàng)研究結(jié)果存在少許差異可能與是否使用抗精神病藥有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)患者組腸道菌群富集放線菌科，與既往研究[9]結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)患者組富集乳桿菌目，對(duì)照組富集毛螺菌屬，這與SHEN等[3]的研究結(jié)果一致，但SHEN等[3]的研究發(fā)現(xiàn)對(duì)照組鏈球菌屬富集，本研究結(jié)果與之不一致。考慮本研究和既往部分研究結(jié)果不一致，可能與研究對(duì)象是否用過抗精神病藥物、樣本量差異及地區(qū)生活習(xí)慣差異等因素有關(guān)，但仍需進(jìn)一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)患者組腸道菌群部分菌屬水平與精神癥狀有關(guān)。SCHWARZ等[11]與本研究都發(fā)現(xiàn)毛螺菌屬與癥狀嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。LI等[8]的研究發(fā)現(xiàn)棒狀桿菌屬的豐度與陰性癥狀負(fù)相關(guān)，而本研究中棒狀桿菌屬與陰性癥狀相關(guān)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。出現(xiàn)不同結(jié)果可能與個(gè)體差異、抗精神病藥物使用有關(guān)。在其他精神疾病與腸道菌群的研究中，鏈球菌屬已被證明在重度抑郁癥患者中豐度較高[12]，神經(jīng)性厭食癥患者毛螺菌屬豐度低于健康對(duì)照[13]，注意缺陷多動(dòng)障礙患者中巨單胞菌屬豐度高于健康對(duì)照[14]。本研究結(jié)果結(jié)合上述研究結(jié)果，推測(cè)鏈球菌屬、毛螺菌屬和巨單胞菌屬在精神疾病中可能具有一定的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)首發(fā)未用藥精神分裂癥患者腸道菌群特征與健康對(duì)照存在差異，部分菌群相對(duì)豐度與精神癥狀相關(guān)。本研究納入的對(duì)象排除了抗精神病藥的影響，研究結(jié)果初步揭示了首發(fā)未用藥精神分裂癥患者腸道菌群多樣性與部分菌屬比例等特征。此外，既往有關(guān)腸道菌群的研究中對(duì)精神癥狀的評(píng)估多數(shù)使用PANSS量表，而本研究除了使用PANSS量表外，還使用了CRDPS量表，增加了癥狀評(píng)估的維度。但本研究仍存在一定局限性，如樣本量較小，這限制了探索腸道菌群差異及評(píng)估精神癥狀和腸道菌群關(guān)系的統(tǒng)計(jì)學(xué)效能。未來研究需進(jìn)一步明確腸道菌群改變和精神分裂癥發(fā)病的因果關(guān)系，為精神分裂癥的早期干預(yù)、治療提供新的理論依據(jù)。