楊鳳鳴，邊汝濤，王振濤

河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450002

擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一種以心室擴(kuò)大并伴有收縮功能障礙為特征的非缺血性心肌病，臨床以心力衰竭為主要表現(xiàn)，并可出現(xiàn)心律失常、猝死等并發(fā)癥[1]?；颊卟∏槌蔬M(jìn)行性加重，常因心力衰竭癥狀加重而反復(fù)住院，約50%的患者可在5年內(nèi)出現(xiàn)死亡，臨床預(yù)后差。目前，本病治療方案同其他原因引起的心力衰竭相似，以β受體阻滯劑、利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑等藥物為主，尚無(wú)特異性治療藥物[2]。

抗纖益心方是河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院王振濤教授根據(jù)DCM的病機(jī)特點(diǎn)研制的有效方藥，方藥組成：黃芪30 g，紅參12 g，丹參15 g，茯苓15 g，升麻9 g，益母草15 g，澤蘭15 g，麥冬12 g，白術(shù)15 g。方中重用黃芪以補(bǔ)宗氣，紅參善補(bǔ)脾胃又可大補(bǔ)元?dú)?，白術(shù)可運(yùn)脾強(qiáng)胃，進(jìn)而維持胃納脾運(yùn)正常，輔以升麻升陽(yáng)舉陷；因DCM患者病機(jī)復(fù)雜，常有瘀血、水濕停留，故加入茯苓、益母草、丹參、澤蘭等化瘀利水，佐以麥冬防止過(guò)燥傷陰。前期研究表明，本方不僅可以改善DCM患者心功能，促進(jìn)心室逆重構(gòu)[3]，還可以減輕DCM大鼠心肌組織病理?yè)p傷，通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性改善膠原合成和降解之間的平衡，降低心肌間質(zhì)Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)水平[4-6]，但其抑制心肌纖維的機(jī)制仍不明確。研究表明，Ras 同源蛋白家族成員A (ras homologous family member A，RhoA)及調(diào)控因子Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶2(rho associated coiled coil forming protein kinase 2，ROCK2)在心肌纖維化中發(fā)揮重要的作用[7]，本研究以RhoA/ROCK2 信號(hào)通路為切入點(diǎn)，建立DCM大鼠模型，探討抗纖益心方抑制心肌纖維化的可能作用機(jī)制，為臨床治療DCM提供新的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4周齡SPF 級(jí)Wistar雄性大鼠80只，體質(zhì)量為(50±18)g，購(gòu)買自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證編號(hào)：SYXK(京)-2016-0006，飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，恒溫恒濕，溫度控制在(22±2) ℃，濕度為50%～60%，12 h/12 h明暗交替。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均符合相關(guān)管理準(zhǔn)則并通過(guò)河南省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查(審查批號(hào)：2019-03-07)。

1.2 藥物與試劑抗纖益心方顆粒(四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：17010092)；卡托普利(上海信誼藥廠有限公司，規(guī)格：每片20 mg，批號(hào)：63470904)；呋喃唑酮(天津力生制藥股份有限公司，規(guī)格：每片0.1 g，批號(hào)：1905012)。HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：G1120、G1340)；可溶性生長(zhǎng)刺激表達(dá)基因2蛋白(soluble growth stimulating factor 2，sST2)試劑盒、半乳糖凝集素-3(galectin-3，Gal-3)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，貨號(hào)：CSB-E13789h、CSB-EL012887RA)；β-actin、RhoA抗體、ROCK2抗體、肌球蛋白磷酸酶靶標(biāo)亞基1(myosin phosphatase target subunit 1，MYPT1)抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：60008-1-LG、10749-1-AP、21645-1-AP、22117-1-AP)；磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶標(biāo)亞基1(phospho-MYPT1，p-MYPT1)抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司，貨號(hào)：4563T)；辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的兔抗山羊lgG、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠lgG(武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào)：GB23204、GB23301)。

1.3 儀器Acuson Cypress型西門子超聲儀(德國(guó)西門子公司)；FC-51119150型酶標(biāo)儀(賽默飛儀器有限公司)；HD-330型生物切片機(jī)(湖北惠達(dá)儀器有限公司)；ICES-003型高倍顯微鏡(日本尼康公司)；170-4070型垂直電泳儀、170-8265型凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 模型建立、分組與給藥4周齡SPF 級(jí)Wistar雄性大鼠80只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)數(shù)字表法選取10只作為正常組，其余70只參照本課題組前期造模方法，用呋喃唑酮溶液(700 mg·L-1)自飲水喂養(yǎng)建立DCM模型[8-9]。10周后行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，與正常組比較，造模大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)顯著升高(P<0.01)，左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction LVEF)、左心室短軸縮短率(left ventricular short axis shortening rate，LVFS)顯著降低(P<0.01)為造模成功。將45只造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、抗纖益心方高、中、低劑量組及卡托普利組，每組9只。根據(jù)人與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用藥劑量換算方法[10]，大鼠的等效劑量相當(dāng)于人的 6.3 倍，抗纖益心方顆粒成人每日用量17.2 g，成年人體質(zhì)量按60 kg計(jì)算，抗纖益心方高、中、低劑量組大鼠按3.6 g·kg-1、1.8 g·kg-1、0.9 g·kg-1的劑量灌胃，卡托普利組大鼠灌胃劑量為 10.125 mg·kg-1，正常組、模型組灌胃等體積的生理鹽水。藥物干預(yù)同時(shí)，除正常組，其余組大鼠繼續(xù)飲用呋喃唑酮溶液以保證致病因素的持續(xù)存在。藥物連續(xù)干預(yù)4周，末次給藥后禁食不禁水12 h，采用體積分?jǐn)?shù)4%水合氯醛以8 mL·kg-1劑量腹腔注射麻醉，麻醉成功后進(jìn)行各指標(biāo)檢測(cè)。

2.2 心臟功能檢測(cè)將大鼠仰臥位固定于大鼠板上，選擇合適角度通過(guò)M型超聲心動(dòng)圖在左側(cè)胸骨旁檢測(cè)LVEDD、LVESD，選取3個(gè)不同心動(dòng)周期結(jié)果取平均值，采用Teichholtz法[11]，計(jì)算大鼠LVEF和LVFS。

2.3 病理組織學(xué)檢查腹主動(dòng)脈取血后迅速開(kāi)胸摘取心臟，在預(yù)冷的無(wú)菌生理鹽水中沖洗殘留血液，切取部分左心室組織用體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定。將固定好的心室組織包埋脫水后以5 μm厚度行石蠟切片，根據(jù)試劑盒提供的方法行HE染色和Masson染色，隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行觀察，光學(xué)顯微鏡下觀察各組心肌組織中肌紅蛋白、細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)及心肌纖維化情況并記錄，并計(jì)算每張切片心肌中膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)[12]。

2.4 ELISA法檢測(cè)血清中sST2和Gal-3的水平超聲檢測(cè)后，在無(wú)菌工作臺(tái)用無(wú)菌手術(shù)剪打開(kāi)腹腔，分離出腹主動(dòng)脈進(jìn)行取血，每只約2 mL，室溫靜置30 min，3 000 r·min-1離心15 min，取上清即為血清。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中sST2和Gal-3的水平。

2.5 Western Blot法檢測(cè)心肌組織中RhoA、ROCK2、MYPT1、p-MYPT1蛋白表達(dá)水平將心室組織在RIPA裂解緩沖液中勻漿，離心后提取總蛋白上清液。BCA法蛋白定量后電泳分離總蛋白，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%脫脂蛋白奶粉 37 ℃ 封閉，4 ℃過(guò)夜孵育一抗(RhoA、ROCK2、MYPT1及p-MYPT1稀釋比例分別為：12 000、11 500、12 000、1500)。洗滌后二抗孵育 1.5 h(特異性兔抗山羊IgG抗體145 000稀釋；山羊抗小鼠IgG抗體16 000稀釋)。化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，Image Lab凝膠圖像系統(tǒng)分析各條帶的光密度值，以β-actin為內(nèi)參標(biāo)化各樣品蛋白電泳條帶的光密度值，以正常組蛋白表達(dá)水平為基準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 抗纖益心方對(duì)DCM大鼠心臟功能的影響在藥物干預(yù)過(guò)程中，模型組大鼠死亡2只，抗纖益心方中、低劑量組大鼠各死亡1只，正常組和卡托普利組大鼠因灌胃操作不當(dāng)各死亡1只。超聲心動(dòng)圖檢查大鼠心臟功能發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組大鼠LVEDD、LVESD顯著升高(P<0.01)，LVEF、LVFS顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，抗纖益心方高、中劑量組和卡托普利組大鼠LVEDD、LVESD顯著降低(P<0.05)，LVEF、LVFS顯著升高(P<0.05)，而抗纖益心方低劑量組大鼠的心功能改善不明顯。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心臟功能的比較

3.2 抗纖益心方對(duì)DCM大鼠心肌組織病理的影響HE染色顯示，正常組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整。模型組大鼠心肌腫大、紊亂、死亡，肌紅蛋白排列紊亂；抗纖益心方高、中劑量組和卡托普利組大鼠心肌細(xì)胞水腫減輕，肌紅蛋白排列改善明顯；而抗纖益心方低劑量組大鼠病理改善不明顯，仍有大量心肌細(xì)胞腫大、肌紅蛋白排列紊亂。Masson染色結(jié)果顯示，正常組大鼠心肌組織膠原蛋白沉積不明顯。與正常組比較，模型組大鼠心肌組織膠原蛋白過(guò)度沉積，心肌纖維化明顯，CVF顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，抗纖益心方高、中劑量組和卡托普利組大鼠心肌組織膠原蛋白沉積改善，心肌纖維化明顯減輕，CVF顯著降低(P<0.05)；而抗纖益心方低劑量組大鼠心肌組織膠原蛋白沉積改善不顯著。見(jiàn)圖1-圖2，表2。

表2 各組大鼠CVF結(jié)果的比較

注：A：正常組；B：模型組；C：抗纖益心方高劑量組；D：抗纖益心方中劑量組；E：抗纖益心方低劑量組；F：卡托普利組

注：A：正常組；B：模型組；C：抗纖益心方高劑量組；D：抗纖益心方中劑量組；E：抗纖益心方低劑量組；F：卡托普利組

3.3 抗纖益心方對(duì)DCM大鼠血清中sST2和Gal-3含量的影響與正常組相比，模型組大鼠血清中sST2和Gal-3含量明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，抗纖益心方高、中劑量組和卡托普利組大鼠血清中sST2和Gal-3含量降低(P<0.05)，抗纖益心方低劑量組大鼠血清中sST2和Gal-3的水平變化不顯著。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清中sST2和Gal-3含量的比較

3.4 抗纖益心方對(duì)DCM大鼠心肌組織中RhoA、ROCK2、MYPT1、p-MYPT1蛋白表達(dá)水平的影響與正常組比較，模型組大鼠心肌組織中RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),MYPT1蛋白磷酸化水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，抗纖益心方高、中劑量組與卡托普利組RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，MYPT1蛋白磷酸化水平顯著降低(P<0.05)；而抗纖益心方低劑量對(duì)各蛋白的表達(dá)量無(wú)明顯影響。見(jiàn)圖3，表4。

注：A：正常組；B：模型組；C：抗纖益心方高劑量組；D：抗纖益心方中劑量組；E：抗纖益心方低劑量組；F：卡托普利組

表4 各組大鼠RhoA、ROCK2、MYPT1及p-MYPT1蛋白表達(dá)的比較

4 討論

DCM根據(jù)臨床表現(xiàn)與中醫(yī)的“心脹”“喘證”“胸痹”等相對(duì)應(yīng)。既往研究認(rèn)為，DCM多為心氣虧虛。本課題組通過(guò)長(zhǎng)期理論研究和臨床觀察發(fā)現(xiàn)宗氣下陷為DCM的基本病機(jī)，在宗氣“貫心脈”理論指導(dǎo)下，研制了具有益氣活血的方藥抗纖益心方，在臨床使用中根據(jù)患者舌脈、心率、血壓等變化調(diào)整使用劑量，取得了良好的療效?？估w益心方作為中藥復(fù)方，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，其可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞能量代謝及部分與心肌纖維化相關(guān)的蛋白而發(fā)揮作用[13-14]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，抗纖益心方組成藥物中的黃芪甲苷、黃芪多糖、人參皂甙Re等有效成分具有抑制心肌纖維化作用[15-16]，這可能是本方發(fā)揮治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

心室重構(gòu)是DCM的主要病理表現(xiàn)，而過(guò)度的心肌纖維化使心室收縮、舒張功能受損，是導(dǎo)致本病惡化的重要機(jī)制[17-18]。在DCM的早期，心肌細(xì)胞代謝異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死，而心肌為了維持收縮功能導(dǎo)致纖維化增加，過(guò)度的心肌纖維化可增加心肌的硬度、降低心臟功能、改變心臟電生理結(jié)構(gòu)。心肌纖維化的主要特征在于膠原代謝的異常和心肌各型細(xì)胞比例的失調(diào)，而膠原代謝失調(diào)主要來(lái)源于心肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和膠原蛋白的異常分泌，進(jìn)而導(dǎo)致各型膠原比例失調(diào)。心肌纖維化受多種刺激因子調(diào)控，如血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)、兒茶酚胺、生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子-β1等。研究表明，呋喃唑酮可通過(guò)抑制兒茶酚胺清除，導(dǎo)致心肌細(xì)胞腫脹、壞死，進(jìn)而導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生[19]，能夠反應(yīng)DCM心室重構(gòu)的病理過(guò)程，故本研究選用呋喃唑酮復(fù)制的DCM大鼠模型用于抗纖益心方的機(jī)制研究?？ㄍ衅绽鳛橹委烡CM的基礎(chǔ)用藥，可改善并抑制心肌纖維化[20]，因此本實(shí)驗(yàn)選擇卡托普利作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。本研究發(fā)現(xiàn)，抗纖益心方可以改善心臟功能，抑制DCM大鼠心肌纖維化水平，改善心肌組織病理?yè)p傷，與前期研究結(jié)果一致[4-8]。

近年來(lái)，多種血清標(biāo)志物用于預(yù)測(cè)心肌纖維化與不良事件之間潛在聯(lián)系，sST2和Gal-3作為心肌纖維化的生物標(biāo)志物和心力衰竭、DCM患者預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo)[21]。多項(xiàng)研究證實(shí)，抑制Gal-3水平會(huì)減緩心肌纖維化的進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，抗纖益心方可以降低模型大鼠血清中sST2和Gal-3含量，可能與改善心肌纖維化水平有關(guān)。此外，在DCM心肌中存在神經(jīng)體液系統(tǒng)的過(guò)度激活，而過(guò)度激活的RAS系統(tǒng)可升高心肌局部AngⅡ 水平，AngⅡ 作為重要的神經(jīng)體液因子，不僅對(duì)心血管系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)功能，還是多種病理活動(dòng)的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ 可通過(guò)激活RhoA/ROCK2信號(hào)通路表達(dá)促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生，但其機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

RhoA屬于小Ras超家族中小分子G蛋白之一，生理狀態(tài)下參與平滑肌收縮、細(xì)胞分裂和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等。RhoA及下游效應(yīng)分子ROCK是細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的中轉(zhuǎn)站[22]。ROCK包括兩個(gè)高度同源亞基，即ROCK1和ROCK2，兩者普遍存在于各種組織中。ROCK2過(guò)度激活可促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，使膠原蛋白代謝失衡，從而引起心肌纖維化[23-24]。目前研究認(rèn)為，ROCK2是平滑肌收縮功能中最重要的下游效應(yīng)靶蛋白，其表達(dá)水平可通過(guò)檢測(cè)其下游底物MYPT1磷酸化水平評(píng)估。因此，MYPTI與p-MYPTI的表達(dá)水平常可反映ROCK的活性[25]。RhoA/ROCK2信號(hào)通路在成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)分化中占有重要的地位，既可以直接促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞對(duì)膠原蛋白的分泌，也可以激活其他纖維化相關(guān)信號(hào)通路，因此，抑制RhoA/ROCK2信號(hào)通路過(guò)度上調(diào)是治療心肌纖維化的新靶點(diǎn)[26-27]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，DCM模型大鼠心肌組織中RhoA/ROCK2信號(hào)通路過(guò)度激活，而抗纖益心方可以通過(guò)調(diào)節(jié)RhoA/ROCK2信號(hào)通路中關(guān)鍵分子RhoA、ROCK2、p-MYPTI的表達(dá)水平抑制心肌纖維化。

綜上所述，抗纖益心方可能是通過(guò)調(diào)節(jié)RhoA/ROCK2信號(hào)通路的表達(dá)發(fā)揮改善DCM大鼠心肌纖維化的作用。本研究為臨床上DCM的治療提供理論依據(jù)，并為更好地了解抗纖益心方的作用機(jī)制提供新的信息。